(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210642552.7 (22)申请日 2022.06.08 (71)申请人 扬州绿源生物化工有限公司 地址 225008 江苏省扬州市邗江区小官桥 路6号 申请人 江苏里下河地区农业科 学研究所 (72)发明人 刘琴　徐健　李传明　韩光杰　 黄立鑫　陆玉荣　夏扬　 (74)专利代理 机构 扬州启达知识产权代理事务 所(普通合伙) 32563 专利代理师 李楠　周青 (51)Int.Cl. A01K 67/033(2006.01) C12N 1/20(2006.01) A01N 63/12(2020.01)A01P 7/04(2006.01) (54)发明名称 斯氏线虫的培养方法、 斯氏线 虫蛹胶囊制剂 及其制备方法 (57)摘要 本发明属现代农业技术领域。 斯氏线 虫的培 养方法： 以草地贪夜蛾的蛹作为斯氏线虫的生物 反应器， 蛹体内注射斯氏线虫内生细菌进行内生 菌繁殖后， 接种斯氏线虫， 通过自然气孔侵染进 入蛹体内， 取食内生菌和蛹细胞组织繁殖生产昆 虫病原昆虫。 昆虫病原线虫蛹胶囊， 利用上述斯 氏线虫的培养方法， 形成蛹蜕自然包裹昆虫病原 线虫的蛹胶囊， 蛹表面以聚乙烯醇包衣水溶性半 透膜， 获得斯氏线虫蛹胶囊制剂。 本发明还公开 了昆虫病原线虫蛹胶囊的制备方法。 本发明用以 解决当前昆虫病原线虫培养工艺过程复杂、 生产 成本高、 剂型加工难度大、 低温保存成本高的技 术问题。 权利要求书1页 说明书5页 附图1页 CN 114916504 A 2022.08.19 CN 114916504 A 1.斯氏线虫的培 养方法， 其特 征是， 所述培 养方法为： 以草地贪夜蛾的蛹作为斯氏线虫的生物反应器， 蛹体内注射斯氏线虫内生细菌进行内 生菌繁殖后， 接种斯氏线 虫， 通过自然气孔侵染进入蛹体内， 取食内生菌和蛹细胞 组织繁殖 生产昆虫病原昆虫。 2.根据权利要求1所述的斯氏线虫的培 养方法， 其特 征在于， 所述培 养方法具体为： （1） 选择人工饲料批量饲养繁殖的草地贪夜蛾1 ‑3日龄蛹为昆虫病原线虫的生物反应 器； （2） 斯氏线虫内生经细菌用微量注射器注射入1 ‑3日龄草地贪夜蛾蛹腹部， 室温培养 24h蛹内增殖内生细菌； （3） 将侵染期斯氏线虫接种到注入内生菌的草地贪夜蛾蛹上进行感染， 繁殖生产斯氏 线虫。 3.根据权利要求2所述的斯氏线虫的培养方法， 其特征是， 步骤 （2） 斯氏线虫内生菌的 接种方法， 具体为侵染期虫态斯氏线虫体内分离的专性内生细菌， 涂布NBTA培养基平板呈 蓝色目标菌落， 接种TSB培 养基中振荡培 养24h获得内生菌 培养液； 以无菌水稀释内生菌培养 液至1×105cfu/ml供注射接种， 选 择1日龄草地贪夜蛾蛹接种 300‑500cfu/头斯氏线虫内生菌以繁殖内生细菌 。 4.根据权利要求2所述的斯氏线虫的培养方法， 其特征是， 步骤 （3） 线虫感染方法， 具体 为： 接种斯氏线虫内生细菌24h的蛹， 平铺于底部垫有湿润 滤纸的容器中， 将侵染期斯氏线 虫悬浮液按每头蛹5 00‑1500IJs的量均匀喷施到蛹上， 相对湿度90%、 20 ‑25℃培养3  ‑5d。 5.根据权利要求4所述的斯氏线虫的培养方法， 其特征是， 侵染期斯氏线虫悬浮液均匀 喷施到蛹上的量 为每头蛹10 00‑1500IJs。 6.斯氏线虫蛹胶囊制 剂， 其特征是， 利用权利要求1 ‑5任一项所述的斯氏线虫的培养方 法， 形成蛹蜕自然包裹昆虫病原线 虫的蛹胶 囊， 蛹表面以聚乙烯醇包衣水溶性半透膜， 获得 斯氏线虫蛹 胶囊制剂。 7.斯氏线虫蛹胶囊制 剂的制备方法， 其特征是， 利用权利要求1 ‑5任一项所述的斯氏线 虫的培养方法， 形成蛹蜕自然包裹昆虫病原线虫的蛹 胶囊； 10% （w/w） 的聚乙烯醇水溶液喷淋蛹体表面， 使蛹全部湿润， 室温条件下风干后蛹表面 形成水溶性半透膜， 获得斯氏线虫蛹 胶囊制剂。 8.根据权利要求7的斯氏线虫蛹胶囊制 剂， 其特征是， 所述斯氏线虫蛹胶囊制 剂的贮存 温度为15 ‑25℃。 9.根据权利要求7的斯氏线虫蛹胶囊制 剂， 其特征是， 所述斯氏线虫蛹胶囊制 剂的贮存 温度为15 ‑20℃。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114916504 A 2斯氏线虫的培养方 法、 斯氏线虫蛹胶囊制剂及其制备方 法 技术领域 [0001]本发明属现代农业领域， 涉及一种昆虫病原线虫的增殖和蛹 胶囊的制备 方法。 背景技术 [0002]昆虫病原线虫(Ent omopathogenic  nematodes)属于线虫门小杆目， 主要包括斯氏 线虫属 (Steinernema)和异小杆线虫属(Heterorhabditis)， 是一类重要的天敌生物， 对害 虫种群增  长起着自然调节的作用。 昆虫病原线虫肠道前端携带共生菌， 以3龄侵染期虫态 (Infective Juveniles， IJs)存活于土壤和水体中。 侵染期线虫通过昆虫表皮的自然开口 (口器、 气孔、  肛门等)、 伤口或节间膜侵入寄主体内， 在昆虫血腔中释放其肠道共生细菌， 共生菌增殖并产  生毒素而导致昆虫死亡， 线虫则以共生菌细胞和虫体组织为营养生长繁 殖产生下一代侵染期  幼虫。 斯氏线虫能引起寄主快速死亡， 而且具有搜索宿主靶标的功 能 ， 成为研究应用最多的  昆虫病原线虫类群， 目前已鉴定了小卷蛾斯氏线虫 (S.carpocapsae)、 海滨斯氏线虫(S.litorale)  等60多个种， 寄主范围包括鳞翅目、 鞘翅 目、 同翅目等多种农林害虫。 由于昆虫病原线虫资  源广泛、 寄主范围广、 感染致死效率高、 环境生态安全、 不易产生抗性、 可规模培养， 同时  可借助水膜进 行水平和垂 直运动， 通过感 知寄主呼吸产生的CO2等气味而主动搜寻和感染隐  蔽害虫， 在害虫生物防治中表现出重要 的研究价 值和应用潜力。 [0003]病原线虫广泛应用于害虫生物防治的关键是病原线虫的高效培养技术。 基于昆虫 病原线 虫行为学、 规模化繁殖生产技术、 病原线虫防治应用等方面的技术突破， 美国、 韩 国、 澳大 利亚、 加拿大、 以色列等 发达国家均成功 开发了病原线 虫生物杀虫剂， 商品化的线 虫品系100  多种， 应用于农林、 高尔夫球场、 花卉等多种害虫防治， 销售额占生物农药市场 的13％， 成  为仅次于苏云金 杆菌(Baci llus thuringiensis)的新型活体生物杀 虫剂。 [0004]目前， 昆虫病原线虫的培养根据繁殖载体的不同主要分为活体繁殖方法和离体繁 殖方法。 昆虫寄主活体培养是早期昆虫病原线虫应用的培养方式， 其培养策是使用敏感、 易人工饲  养繁殖的昆虫寄主来培养昆虫病原线虫。 一般是利用大蜡螟等幼虫作为敏感宿 主， 通过感染  期线虫自然入侵到幼虫体内， 释放内生菌致死属主并生长， 繁殖产生子代线 虫。 收集死亡虫  体中的繁殖线 虫通过分离收集、 无菌水清洗剂、 载体吸附、 低温保存等步骤 再加工成相应线  虫制剂。 由于培养过程较复杂、 工艺参数无标准， 难以形成批量生产。 离体 培养是则通过分  离共生菌， 通过固体培养基或发酵罐进行液体培养。 其技术原理在于病原 线虫主要以共生菌  为饲料， 通过无菌条件下繁殖共生菌并补充必要的C/N营养物质， 接种 昆虫病原线虫生长繁  殖产生子代。 固体培养是将感染期幼虫接种到相 应的共生细菌的纯 培养基中进 行培养， 但存  在稳定性不高， 培养时间较长， 生产效率低的问题。 液体培养是目 前线虫规模化生长的主  要方法， 使用生物发酵系统(发酵罐)培养内生菌， 当内生细菌繁殖 到一定数量时接种线虫  繁殖产生后代。 通常从开始培养算起， 15 ‑20d后可收集感染期幼 虫。 但液体培养技术要求高、  投入大， 发酵培养过程需要监测各种理化参数并对温度、 pH和 溶氧等参数进行监控， 接种线  虫对培养基和培养条件敏感， 感染期幼虫的恢复状态难控说　明　书 1/5 页 3 CN 114916504 A 3