(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210645474.6 (22)申请日 2022.06.09 (83)生物保 藏信息 CCTCC NO： M202 2222 2022.03.09 (71)申请人 吉林省农业科 学院 地址 130033 吉林省长 春市净月开发区彩 宇大街13 63号 (72)发明人 李盛钰　杨舸　高岩松　吴兴宏　 赵子健　高磊　 (74)专利代理 机构 长春众邦菁华知识产权代理 有限公司 2 2214 专利代理师 于晓庆 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12P 33/20(2006.01)C12R 1/25(2006.01) (54)发明名称 植物乳植杆菌GLP40及其在发酵转化制备稀 有人参皂苷Rk3中的应用 (57)摘要 植 物 乳 植 杆 菌 (La c t i pla n ti ba c illusplantarum)GLP40及其在发酵转化制备稀 有人参皂苷Rk3中的应用， 涉及益生菌发酵领域， 该菌株已于2022年03月09日保藏于中国典型培 养物保藏中心， 保藏编号为： CCTCCNO： M2022222。 本发明确定了菌株GLP40发酵转化制备稀有人参 皂苷Rk3的新工艺， 同时采用HPLC法对转化后的 稀有人参皂苷Rk3进行了鉴定。 该工艺能以人参 总皂苷提取物 为原料， 获得含量较高的稀有人参 皂苷Rk3， 该工艺具有 安全、 高效、 成本低廉、 反应 温和等优点， 该工艺适合规模化工业生产， 所制 备的稀有人参皂苷Rk3用途广泛， 应用前 景广阔。 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图3页 CN 115093992 A 2022.09.23 CN 115093992 A 1.植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus  plantarum)GLP40， 其特征在于， 该菌株已于 2022年03月09日保藏于中国典型培 养物保藏中心， 保藏编号 为： CCTCC NO： M2022222。 2.如权利要求1所述的植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus  plantarum)GLP40在发酵 转化制备稀有人参皂苷Rk3中的应用。 3.根据权利要求2所述的应用， 其特 征在于， 包括以下步骤： 制备植物乳植杆菌(Lactip lantibacillus  plantarum)GLP40菌悬液， 将其接种至灭菌 后的液体发酵培养基， 加入经过滤除菌的人参总皂苷提取物共同发酵培养； 所得发酵产物 依次经低 温减压浓缩、 冷冻干燥、 萃取、 离心后， 所得上清再经减压回收溶剂、 冷冻干燥后， 获得含有稀有人参皂苷Rk3的干燥产物； 采用HPLC法对干燥产物进行鉴定 。 4.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于， 所述植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus   plantarum)GLP40 菌悬液的制备 方法如下： 将植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus  plantarum)GLP40接种于液体MRS培养基， 37 ～45℃静置培养16～25h， 4～10℃、 4000～8000rpm离心5～10min， 收集菌体沉淀； 用发酵 灭 菌培养基水溶液悬浮， 调整活菌数为1.0 ×109～1.0×1010CFU/ml， 获得植物乳植杆菌 (Lactiplantibaci llus plantarum)GLP40 菌悬液。 5.根据权利要求3所述的应用， 其特 征在于， 所述人参总皂苷提取物的制备 方法如下： 将人参根粉经80～100℃热水提取， 所得提取液经减压浓缩、 冷冻干燥后， 获得粗皂苷 粗提物， 再经D101大孔树脂柱层析， 以不同浓度乙醇洗脱， 收集洗脱液， 回收溶剂后进行冷 冻干燥获得 人参总皂苷提取物。 6.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于， 所述液体发酵培养基包括： 葡萄糖2～5g/ L， 酵母浸粉1～3g/L， pH 6.0～7.0， 121℃灭菌15mi n。 7.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于， 所述液体发酵培养基中， 人参总皂苷提取 物的添加量为10～20g/L， 所述植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus  plantarum)GLP40菌 悬液的接种量 为10～30ml/L。 8.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于， 所述共同发酵培养的温度为37～42℃， 静 置发酵7～14天。 9.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于， 所述发酵产物依次经70℃低温减压浓缩， 冷冻干燥， 甲醇萃取， 10 000rpm、 15mi n、 4℃离心后获得 上清。 10.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于， 所述采用HPLC法对干燥产物进行鉴定的 具体过程如下： 将含有稀有人参皂苷Rk3 的干燥产物溶于 甲醇， 经0.22μm微孔滤膜过滤后进行HPLC色 谱分析， 色谱柱为Agilent  pursuit5 SB‑C18色谱柱， 进样量2 0 μL， 流速1mL/min， 柱温30℃， 检测波长2 03nm； 流动相为A： 水， B： 乙腈， 0～40min  18～21％(B)； 40～42min  21～26％(B)； 42～46min  26～32％(B)； 46～66min  32～34％(B)； 66～71min  34～38％(B)； 71～ 77.70min  38.0～49.1 ％(B)； 77.70～82min  49.1％(B)； 82～83min49.1～50.6％(B)； 83～ 88min 50.6～59.6％(B)； 88～89.80min  59.6～65.0％(B)； 89.80～97min  65％(B)； 97～ 102min 65～75％(B)； 102～110min  75～85％(B)； 110～115min  85％(B)； 115～125min  85 ～18％(B)； 125～13 0min 18.0％(B)。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115093992 A 2植物乳植杆菌GLP40及其在发酵转化制备稀有人参皂苷Rk3中 的应用 技术领域 [0001]本发明涉及益生菌发酵技术领域， 具体涉及一种植物乳植杆菌GLP40及其在发酵 转化制备稀有人参皂苷Rk3中的应用。 背景技术 [0002]目前， 人参皂苷向稀有人参皂苷的转化途径有很多， 例如在酸性环境下加热酸水 解， 制备稀有 人参皂苷。 但是这种转化途径特异 性低， 反应剧烈， 且酸液无法回收， 造成大量 的环境污染。 也有 学者使用微波辅助降解人参皂苷， 使其向稀有 人参皂苷转化， 这种方式的 缺点是高能源、 高成本， 不利于大规模工业 生产。 [0003]近些年来， 微生物转化天然产物的研究逐渐兴起， 有学者使用细菌、 真菌等微生物 对人参皂苷进行发酵， 均能得到C ‑K、 Rg3等稀有人参皂苷， 但其使用的发酵菌种 来源不明， 甚至是使用对人体有害的致病菌， 这显著降低了产品的安全性。 已有研究表明， 使用能够产 生β‑葡萄糖苷酶和β ‑半乳糖苷酶的乳酸菌如干酪乳杆菌、 副干酪乳杆菌、 嗜酸乳杆菌等， 均 能够以人参总皂苷提取物为底物， 对其进行发酵转化， 并成功得到Rg3、 F2、 C ‑K等稀有人参 皂苷， 但利用这些菌种转 化稀有人参皂苷Rk3的报道并不多。 发明内容 [0004]有鉴于此， 本发明的目的在于提供一种植物乳植杆菌GLP40及其在发酵转化制备 稀有人参皂苷Rk3中的应用， 为稀有人参皂苷Rk3的制备提供一条新的途径。 [0005]为了实现上述发明目的， 本发明提供了如下技 术方案： [0006]本发明的植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus  plantarum)GLP40， 该菌株已于 2022年03月09日保藏于中国典型培 养物保藏中心， 保藏编号 为： CCTCC NO： M2022222。 [0007]本发明的植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus  plantarum)GLP40在发酵转化制 备稀有人参皂苷Rk3中的应用。 [0008]作为优选的实施方式， 包括以下步骤： [0009]制备植物乳植杆菌(Lact iplantibacillus  plantarum)GLP40菌悬液， 将其接种至 灭菌后的液体发酵培养基， 加入经过滤除菌的人参总皂苷提取物共同发酵培养； 所得发酵 产物依次经低温减压浓缩、 冷冻干燥、 萃 取、 离心后， 所得上清再经减压回收溶剂、 冷冻干燥 后， 获得含有稀有人参皂苷Rk3的干燥产物； 采用HPLC法对干燥产物进行鉴定 。 [0010]作为优选的实施方式， 所述植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus  plantarum) GLP40菌悬液的制备 方法如下： [0011]将植物乳植杆菌(Lactiplantibacillus  plantarum)GLP40接种于液体MRS培养 基， 37～45℃静置培养16～25h， 4～10℃、 4000～8000rpm离心5～10min， 收集菌体沉淀； 用 发酵灭菌培养基水溶液悬浮， 调整活菌数为1.0 ×109～1.0×1010CFU/ml， 获得植物乳植杆 菌(Lactiplantibaci llus plantarum)GLP40 菌悬液。说　明　书 1/5 页 3 CN 115093992 A 3