(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210715092.6 (22)申请日 2022.06.22 (71)申请人 华中农业大 学 地址 430070 湖北省武汉市洪山区狮子山 街1号 (72)发明人 王小红　丁一峰　王佳　邵彦春　 黄晨曦　王源上　付琪　 (74)专利代理 机构 武汉开元知识产权代理有限 公司 42104 专利代理师 冯超 (51)Int.Cl. C07K 14/01(2006.01) C07K 1/22(2006.01) C12N 15/34(2006.01) C12N 15/70(2006.01)C12N 1/21(2006.01) C12N 1/02(2006.01) C12N 1/20(2006.01) G01N 33/569(2006.01) G01N 33/543(2006.01) G01N 33/58(2006.01) G01N 21/31(2006.01) G01N 21/78(2006.01) C12R 1/42(2006.01) (54)发明名称 沙门氏菌噬菌体尾部受体结合蛋白RBP 41 及其在富 集与检测沙门氏菌中的应用 (57)摘要 本发明公开一种沙门氏菌噬菌体尾部受体 结合蛋白RBP  41及其在富集与检测沙门氏菌中 的应用； 其氨基酸序列为SED  ID No.1； 本发明的 RBP 41能够识别并结合沙门氏菌表面的受体， 将 其与活化的羧基磁珠偶联， 形成RBP  41‑MBs。 本 发明利用探针RBP  41‑MBs构建快速富集沙门氏 菌的磁分离试剂盒， 并建立基于尾部受体结合蛋 白的磁分离酶联免疫法检测沙门氏菌方法， 将基 于96孔板的传统ELISA改进 为基于磁珠的MA EIA， 实现待测样品的定性与定量检测。 本发明富集与 检测沙门氏菌时间短， 约为1 .5h， 检测限为 10CFU/mL， 拓展了噬菌体受体 结合蛋白在食品安 全检测中的应用范围。 权利要求书1页 说明书10页 序列表5页 附图3页 CN 115181165 A 2022.10.14 CN 115181165 A 1.一种沙门氏菌噬菌体 尾部受体结合蛋白RBP  41， 其氨基酸序列为SED  ID No.1。 2.一种编码权利要求1所述沙门氏菌噬菌体尾部受体结合蛋白RBP  41的基因orf  41， 其核苷酸序列如SED  ID No.2。 3.一种权利要求1所述尾部受体结合蛋白RBP  41的噬菌体尾部组装伴侣蛋白TAC  34， 其氨基酸序列为SED  ID No.3。 4.根据权利 要求3所述的组装伴侣蛋白TAC  34， 其特征在于： 所述组装伴侣蛋白TAC  34 的编码基因orf  34， 其核苷酸序列如SED  ID No.4。 5.一种重组表达载体pETDuet ‑1‑orf 34‑orf 41， 其特征在于： 所述重组表达载体 pETDuet‑1‑orf 34‑orf 41为含有基因orf  41序列和基因orf  34序列的表达载体， 其中， 所 述表达载体为原核细胞表达载体pETDuet ‑1； 所述基因orf  41的核苷酸序列如SED  ID No.2； 所述基因orf  34的核苷酸序列如SED   ID No.4。 6.含有权利要求5所述重组表达载体的宿主细胞， 其特征在于： 所述宿主细胞为大肠杆 菌BL21。 7.一种权利要求1所述噬菌体尾部受体结合蛋白RBP  41在快速富集沙门氏菌的磁分离 试剂盒以及磁分离酶联免疫法检测沙门氏菌中的应用。 8.利用权利要求6所述含有重组表达载体的大肠杆菌BL21制备噬菌体受体结合蛋白 RBP 41的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 1)将含有重组表达载体pETDuet ‑1‑orf 34‑orf 41的大肠杆菌感受态细胞BL21培养， 用异丙基硫代半乳糖苷诱导后继续培养， 离心， 沉淀用磷酸盐缓冲液PBS重悬， 即为悬浮菌 液； 2)对悬浮菌液进行菌体破碎， 离心收集上清， 经镍柱亲和层析纯化分离， 得到重组的噬 菌体受体结合蛋白RBP  41。 9.一种沙门氏菌噬菌体尾部受体结合蛋白 ‑磁珠探针RBP  41‑MBs的制备方法， 其特征 在于： 包括以下步骤： 1)将羧基化磁珠(20 0nm)进行活化， 得到活化的羧基 磁珠MBs； 2)将权利要求8制备的噬菌体受体结合蛋白RBP  41与活化的羧基磁珠进行偶联， 得到 含有噬菌体受体结合蛋白 ‑磁珠探针RBP  41‑MBs的PBS缓冲液， 且PBS的摩尔浓度为 0.05mol/L， 噬菌体受体结合蛋白 ‑磁珠探针RBP  41‑MBs的摩尔浓度为2mg/mL。 10.一种基于噬菌体尾部受体结合蛋白的快速富集沙门氏菌磁分离试剂盒， 其特征在 于： 所述试剂盒包括含有权利要求9所述沙门氏菌噬菌体尾部受体结合蛋白 ‑磁珠探针RBP   41‑MBs。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115181165 A 2沙门氏菌噬菌 体尾部受体结 合蛋白RBP  41及其在富集与检测 沙门氏菌中的应用 技术领域 [0001]本发明涉及食品安全领域， 具体涉及一种沙门氏菌噬菌体尾部受体结合蛋白RBP   41及其在富 集与检测沙门氏菌中的应用。 背景技术 [0002]沙门氏菌(Salmonella  spp.)是重要的食源性病原体之一， 是引起食源性疾病的 一个主要原因， 对公众健康会构成严重威胁。 它可以在生产、 加工、 分销和营销的各个阶段 进入食品供应链。 目前的沙门氏菌检测方法包括传统培养鉴定、 分子生物学， 免疫 学检测和 生物传感器检测等。 然而为了实现对沙门氏菌的准确、 快速检测， 对待测样品中的沙门氏菌 进行快速准确的分离富 集是必不可少。 [0003]免疫磁分离法(Immunomagnetic  separation， IMS)是将免疫学反应中抗原 ‑抗体 的高特异性与磁珠特有的磁响应性相结合的一种新的免疫学技术。 近年来， 免疫磁分离法 已被应用于食源性致病菌的分离， 在一定程度上可取代传统的增菌培养和常规的离心富集 细菌。 但是免疫磁珠存在一定局限性， 例如： 作为识别元件的高亲和力抗体昂贵且难以获 得， 使得免疫标记磁珠的使用规模 难以扩大。 [0004]噬菌体是一类特异性感染宿主的病毒， 广泛存在于自然界。 噬菌体特异性感染宿 主细胞的第一步为吸附， 此过程依靠噬菌体的尾部受体结合蛋白(receptor  binding  proteins,RBPs)完成。 RBPs是噬菌体颗粒的高度可变结构， 存在于噬菌体尾纤维或者尾刺 的末端， 负责识别细胞表面的特定受体， 因此， RBPs介导的宿主识别 是高度特异性的。 依据 RBPs的这 一特性， 将其用作检测元件有以下优点： [0005]1)利用蛋白外源表达技 术， 易于大量获得RBPs； [0006]2)RBPs具有模块化的性质， 可将具有不同宿主范围的RBPs融合表达， 扩大识别宿 主范围； [0007]3)与易发生重组和突变的完整噬菌体粒子相反， RBPs在生产过程中序列不易发生 重组与突变， 性质稳定， 更适于商业 化； [0008]因此， 将RBPs作为分子识别元件， 在快速、 准确检测食源性病原菌领域具有较好的 应用潜力。 发明内容 [0009]本发明的目的在于克服现有技术的不足， 提供了一种沙门氏菌噬菌体尾部受体结 合蛋白RBP  41及其在富集与检测沙门氏菌中的应用， 并构建了基于尾部受体结合蛋白的磁 分离酶联免疫法(Magnetic  affinity  enzyme‑linked immunosorbent,MAEIA)， 用于沙门 氏菌的检测。 [0010]为实现上述目的， 本发明所设计一种沙 门氏菌噬菌体尾部受体结合蛋白RBP  41， 其氨基酸序列为SED  ID No.1。说　明　书 1/10 页 3 CN 115181165 A 3