(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210891782.7 (22)申请日 2022.07.27 (83)生物保 藏信息 CGMCC NO.： 22031 2021.0 3.18 (71)申请人 闽江学院 地址 350000 福建省福州市闽侯县上街 镇 溪源宫路200号 (72)发明人 林镇跃　陈建明　王蔚　 (74)专利代理 机构 重庆信必达知识产权代理有 限公司 5 0286 专利代理师 李小伟 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12N 1/12(2006.01) C12N 1/02(2006.01)C12Q 1/689(2018.01) C12Q 1/04(2006.01) A01N 63/20(2020.01) A01P 21/00(2006.01) A01K 61/10(2017.01) A01K 61/59(2017.01) A01K 61/50(2017.01) A01K 63/04(2006.01) C12R 1/01(2006.01) C12R 1/89(2006.01) (54)发明名称 用于珊瑚养殖的抗ROS益生菌、 菌剂筛选和 使用方法及应用 (57)摘要 本发明属于海洋益生菌剂技术领域， 公开了 一种用于珊瑚养殖的抗ROS益生菌、 一种用于珊 瑚养殖的抗ROS益生菌菌剂的筛选方法、 一种用 于珊瑚养殖的抗ROS益生菌菌剂的使用方法和一 种用于珊瑚养殖的抗ROS益生菌菌剂的运用； 本 发明基于DMSP活性微生物 群在抗ROS方面展现的 巨大潜力， 得到一种用于珊瑚养殖的抗ROS益生 菌、 菌剂筛选和使用方法及应用， 通过运用微生 态制剂以提高海洋生物具备抗氧化能力的益生 菌群活跃度， 构建和培养珊瑚共生体的抗氧化功 能系统， 降低珊瑚水体的过氧化物水平， 提高珊 瑚共生体的免疫力和抗逆潜力， 改善海缸海水环 境品质， 有效的降低了珊瑚的白化和病害风险， 对各类由“氧化胁迫 ”应激反应引 起的各种疾病 均具有治疗和预防的效果。 权利要求书1页 说明书8页 附图2页 CN 115466691 A 2022.12.13 CN 115466691 A 1.用于珊瑚养殖的抗ROS益生菌， 其特征在于： 所述抗ROS益生菌由A短波单胞菌属菌株 D6菌体、 终浓度不低于1 ×1012细胞/毫升的虫黄藻D型、 终浓度不低于1 ×108细胞/毫升的 DMSP/DMS/AA、 维生素、 氨基酸、 微量元素、 CaCl2和人工海水组成； 所述短波单胞菌株D6由中 国丛生盔形珊瑚组织分离得到， 于2021年3月18日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号 的中国普通微生物保藏管理中心CGMCC， 保存人为中国科学院微生物研究所， 保藏菌号为 CGMCC NO.： 22031。 2.根据权利要求1所述的用于珊瑚养殖的抗ROS益生菌， 其特征在于： 所述短波单胞菌 株D6的培 养温度为25～ 28℃， 盐度为3 0～35‰。 3.根据权利要求1所述的用于珊瑚养殖的抗ROS益生菌， 其特征在于： 所述短波单胞菌 株D6的培 养pH值为7.85～8.45 。 4.用于珊瑚养殖的抗ROS益生菌菌剂的筛选方法， 其特征在于， 利用DMSP活性微生物筛 选得到如权利要求1所述的一种用于 珊瑚养殖的抗ROS益 生菌， 包括以下步骤： S1、 DMSP代谢活性细菌的分离、 纯化及鉴定： 通过对观赏硬骨和软体珊瑚组织、 骨骼及 海水中内源细菌进行原位培养， 以MAMS和MASW基础培养基进行改良， 利用DMSP或DMS或AA作 为唯一碳源， 培养、 分离和纯化DMSP代谢活性细菌， 并对纯化所得细菌的16SrDNA片段进行 PCR扩增， 通过序列比对分析 结合形态学分析进行菌种鉴定； S2、 微生物的性状筛选和功能分析： 利用PCR的方法对上述分离的菌株的DMSP降解和氮 循环功能基因进行扩增， 筛 选出具有硫循环和氮循环的代谢潜力的内源益 生细菌； S3、 抗ROS菌株筛选： 现用过氧化氢酶试验筛选阳性具有抗ROS菌株潜质的菌株， 再用索 莱宝过氧化氢酶活性检测试剂盒进行检测进一步筛选和验证具有较高氧化氢酶活性值菌 株， 最后， 短波单胞菌属菌株D6的过氧化氢酶活性表现最强， 氧化氢酶活性高达0.3768u/ 105细胞， 并以菌株D6用于 珊瑚抗ROS菌剂的开发。 5.根据权利要求4所述的用于珊瑚养殖的抗ROS益生菌菌剂的筛选方法， 其特征在于： 在S2中， DMS P降解得到dmdA、 d ddD、 dddL和dddP， 氮循环得到n ifH和nirK。 6.用于珊瑚养殖的抗ROS益生菌菌剂的使用方法， 其特征在于： 使用 如权利要求1所述 的一种用于珊瑚养殖的抗ROS益生菌的方法， 包括每100L水体中添加10 mL菌液， 使 得总活性 微生物菌群数量≥5 ×1010/L； 每10～15天添加一次菌剂， 使得水体中菌群数量保 持稳定； 在 4～8℃条件下进行低温储 存； 有效期6个月； 使用前摇匀， 使菌群分布均匀。 7.用于珊瑚养殖的抗ROS益生菌菌剂的运用， 其特征在于： 如权利要求1所述的一种用 于珊瑚养殖的抗 ROS益生菌在 海水养殖珊瑚、 鱼、 虾、 贝类养殖中的应用； 在珊瑚礁修复中的 应用。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115466691 A 2用于珊瑚养殖的抗ROS益生菌、 菌剂筛选和使用方 法及应用 技术领域 [0001]本发明涉及海洋益生菌剂 技术领域， 具体为一种用于珊瑚养殖的抗ROS 益生菌， 还 涉及一种用于珊瑚养殖的抗ROS益生菌菌剂的筛选方法、 一种用于珊瑚养殖的抗 ROS益生菌 菌剂的使用方法和一种用于 珊瑚养殖的抗ROS益 生菌菌剂的运用。 背景技术 [0002]活性氧(reactive  oxygen species,ROS)是体内一类氧的单电子还原产物， 概括 的说是指 机体内或者自然环境中由氧 组成,含氧并且性质活泼物质的总称， 主要有1种激发 态的氧分子(一重态氧分子或称单线态氧分子O2)； 3种含氧的自由基(超氧阴离子自由基、 羟自由基 ‑OH和氢过氧自由基HO2),2种过氧化物  (过氧化氢H2O2和过氧化脂质ROOH)及一种 含氮的氧化物NO等。 [0003]珊瑚共生体由珊瑚虫和虫黄藻组成， 虫黄藻一旦离开珊瑚， 珊瑚虫就会变成白色， 然后慢慢死亡， 即珊瑚白化。 与珊瑚虫共生的虫黄 藻利用光照进 行光合作用， 能够为珊瑚提 供高达90％的能源和骨骼生长所需的氧气， 虫黄藻不仅稳定的在珊瑚虫体内生长， 而且从 珊瑚虫体内获得光合作用所需的二氧化碳、 氮和磷等植物营养盐。 珊瑚虫和虫黄藻这种共 生关系不仅清除了珊瑚虫 的代谢废物， 为珊瑚虫创造了更好的生活环境， 同时也为珊瑚生 态系统净化海水环境提供了帮助。 珊瑚白化现象频发， 主要是由于微型海水生态系统自动 调节能力弱， 加上观赏珊瑚(特别是石珊瑚)自身对海水环境波动很敏感， 如缸内温度、 水 质、 光照、 pH、 水流、 营养和离子等参数的波动都有 可能导致珊瑚一 夜之间“白化”。 从生物学 的角度来看， 珊瑚白化最直接生物学机制是 “氧化胁迫 ”， 即当温度升高或光照辐射增强会 导致共生藻的光合系统受损， 而产生过量的ROS自由基， 并泄露到了宿主细胞内造成ROS损 伤， 导致机体免疫力下降引发白化和病害。 大部分观赏生物 生长需要光合作用， 在一定程度 上说海缸系统中的 “氧化胁迫 ”状态不可避免。 如何有效防止珊瑚白化， 目前还没有很好的 方法。 研究发现， 通过微生态制剂技术快速有效降低海缸系统的ROS自由基水平， 实现海洋 观赏生物ROS平衡的稳态控制， 是目前海洋微 生态制剂面临的一大技 术瓶颈。 [0004]珊瑚共生体在长期的进化中获得了一套特殊的抵抗环境变化、 白化和病虫害等逆 境机制—DMSP(二甲基硫丙酸)代谢活性物质， 包括DMS(丙二酸二甲酯)、 AA(丙烯酸)、 DMSO (二甲基亚砜)、 TDA(间甲苯二胺)和其他化合物 等， 其活性物质在抵抗白化、 抗菌性、 后天免 疫与非生物胁迫具有重要的作用。 然而， 目前海洋水族市场中还未有以DMSP代谢活性物质 为基础开发的微 生态制剂。 [0005]由于DMSP可与ROS迅速反应被认为是破坏自由基的有效细胞清除剂， 而且DMSP的 分解产物DMS和丙烯 酸酯在实验室条件 下比DMSP反应性更强,其氧化效率可高出20～60倍， 这三种化合物合构成一种非常有效的抗氧化系统。 本发明针对珊瑚的白化问题， 基于DMSP 活性微生物群在抗ROS方面展现 的巨大潜力， 得到一种用于珊瑚养殖的抗ROS益生菌、 菌剂 筛选和使用方法及应用， 通过运用微生态制剂以提高海洋生物具备抗氧化能力的益生菌群 活跃度， 构建和培养珊瑚共生体的抗氧化功能系统， 降低珊瑚水体的过氧化物水平， 提高珊说　明　书 1/8 页 3 CN 115466691 A 3