(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210810774.5 (22)申请日 2022.07.11 (71)申请人 中国人民解 放军总医院 地址 100853 北京市海淀区复兴 路28号 (72)发明人 蔡芸　杨天立　陈辉玲　白楠　 梁蓓蓓　梁文馨　王瑾　 (74)专利代理 机构 北京京万通知识产权代理有 限公司 1 1440 专利代理师 齐晓静 (51)Int.Cl. C12N 5/071(2010.01) C12N 5/0786(2010.01) C12N 5/078(2010.01) C12N 1/20(2006.01) C12R 1/22(2006.01) (54)发明名称 细菌感染肺类器官模型与免疫微环境共存 体系的构建方法 (57)摘要 细菌感染肺类器官模型与免疫微环境共存 体系的构建方法， 包 括： S1.将固定于Matrigel中 的PDLO消化下来， 添加培养基制备成PDL O悬液并 计数； S2.悬浮培养PDL O悬液， 以修复消化下来的 PDLO； S3.将单克隆菌落培养制备为定量细菌悬 液； S4.将定量细菌 悬液加入PDL O悬液中， 建立细 菌感染肺类器官模型； 以及S5.提取原代PBMC计 数后加入细菌感染肺类器官模型中， 以构建细菌 感染肺类器官模 型与免疫微环境共存体系。 本方 法构建了多细胞种类的PDLO并与常见致病菌及 外周血单个核细胞共培养， 能够显著提高PDL O细 菌感染肺类器官模型与免疫微环境混合共存体 系的构建效率， 有效且 稳定地模拟人体肺部感染 后的机体抗感染反应及免疫反馈的过程。 权利要求书1页 说明书9页 附图7页 CN 115011548 A 2022.09.06 CN 115011548 A 1.一种细菌感染肺类器官模型与免疫微环境共存体系的构建方法， 其特征在于， 包括 以下步骤： S1.将固定于基底膜基质(Matrigel)中的患者来源肺类器官(PDLO)消化下来， 添加培 养基制备成患者 来源肺类 器官(PDLO)悬液并计数； S2.悬浮培养所述患者来源肺类器官(PDLO)悬液， 以修复消化下来的所述患者来源肺 类器官(PDLO)； S3.将单克隆菌落培 养制备为定量细菌悬 液； S4.将所述定量细菌悬液加入所述患者来源肺类器官(PDLO)悬液中， 建立细菌感染肺 类器官模型； 以及 S5.提取原代外周血单个核细胞(PBMC)计数后加入所述细菌感染肺类器官模型中， 以 构建所述细菌感染肺类 器官模型与免疫微环境共 存体系。 2.根据权利要求1的所述的细菌感染肺类器官模型与免疫微环境共存体系的构建方 法， 其特征在于， 在步骤S1 中， 用II型胶原酶将固定于所述基底膜基质(Matrigel)中的患者 来源肺类 器官(PDLO)消化下来。 3.根据权利要求2的所述的细菌感染肺类器官模型与免疫微环境共存体系的构建方 法， 其特征在于， 用浓度为2mg/mL的II型胶原酶将固定于所述基底膜基质(Matrigel)中的 患者来源肺类器官(PDLO)在37℃消化10min， 用杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS)清洗以洗净所述 II型胶原酶。 4.根据权利要求1的所述的细菌感染肺类器官模型与免疫微环境共存体系的构建方 法， 其特征在于， 在步骤S2中， 悬浮培 养所述患者 来源肺类 器官(PDLO)悬液一周。 5.根据权利要求1的所述的细菌感染肺类器官模型与免疫微环境共存体系的构建方 法， 其特征在于， 在步骤S2中， 使用流式管或低吸附孔板进行 悬浮培养。 6.根据权利要求1的所述的细菌感染肺类器官模型与免疫微环境共存体系的构建方 法， 其特征在于， 在步骤S 3中， 将细菌于MHA琼脂板中培养传代至对 数生长期后， 挑取单克隆 菌落至MHB肉汤培 养基中， 随后使用麦氏比浊仪对细菌悬 液进行定量。 7.根据权利要求6的所述的细菌感染肺类器官模型与免疫微环境共存体系的构建方 法， 其特征在于， 在步骤S3中， 将挑取的所述单克隆菌落在所述MHB肉汤培养基中在37℃振 荡培养16h， 随后使用麦氏比浊仪对细菌悬液进行定量， 根据需要的感染复数(MOI)比浊至 1.5×10^7CFU/mL特定浓度的细菌悬 液。 8.根据权利要求1的所述的细菌感染肺类器官模型与免疫微环境共存体系的构建方 法， 其特征在于， 在步骤S5中， 提取原代外周血单个核细胞(PBMC)并进行计数后， 在适当 的 时间点将外周血 单个核细胞(PBM C)悬液加入所述细菌感染肺类 器官模型中。 9.根据权利要求8的所述的细菌感染肺类器官模型与免疫微环境共存体系的构建方 法， 其特征在于， 所述外周血 单个核细胞(PBM C)悬液的浓度为1.5 ×10^5个/mL。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115011548 A 2细菌感染肺类器 官模型与免疫 微环境共存体系 的构建方法 技术领域 [0001]本发明涉及细胞感染技术领域， 尤其涉及 一种细菌感染肺类器官模型与免疫微环 境共存体系的构建方法。 背景技术 [0002]“类器官(Organoid) ”一词早在1946年便被用来描述肿瘤的某些组织学特征[1]。 然 而， 直到2009 年肠类器官的发展[2]， 它才开始专用于描述自组织的体外结构 。 类器官可用于 模拟人体器官发育和各种疾病的病理变化[3]， 而患者来源的类器官(Patient ‑derived  Organoid,PDO)则可以进行广泛的分子诊断和药物筛选， 有望以个体化的方式预测机体对 药物反应。 目前， 对于PDO的研究主要应用于各类肿瘤的免疫调节方面， 在感染性疾病免疫 调节中的应用很少。 [0003]在COVID‑19的疾病进程中， 患者 的自身免疫功能也同时影响着病情变化。 疾病早 期患者仅表现为病毒性感染的一般症状， 如果患者的免疫系统过度激活、 炎症因子急剧增 加， 形成炎症因子风暴后， 死亡率由轻型或普通型的＜4％显著增长至重型或危重型的＞ 50％[5‑8]。 因此， 病程早期进行免疫调节治疗对降低重症转化率和死亡率有重要意义[9,10]。 不仅针对病毒性感染， 全身免疫功能失调是多种病原体 感染性疾病的病理生理基础的基本 分子机制， 可以导致严重的脓毒症和败血症性休克[11]。 免疫系统在炎症性疾病中发挥的重 要作用也备受关注。 [0004]肺类器官(Lung  organoid)主要由两种来源的细胞构建而成： 从成熟肺组织分离 的上皮干/祖细胞[12]和人类多能干细胞[13‑15]， 前者来源的肺类器官称之为患者来源肺类器 官(Patient ‑derived Lung Organoid,PDLO)， 主要包括基底祖细胞、 气道分泌细胞和 Ⅱ型 肺泡上皮细胞(alveolar  epithelial  type 2,AT2 cells) 等。 建立PDLO有助于进一步了 解人类肺部的发育过程和肺部疾病的病理生物学， 这两点都是寻找治疗呼吸系统疾病新方 法的关键。 目前为止， 人类肺部发育、 修复和再生的几个重要研究结果 都是从小鼠模型中推 断出来的[16]。 然而， 人与鼠的肺组织之间存在着许多内在差异， 如基底细胞遍布于人体气 道， 但在小鼠中仅限于气管， 亦如杯状细胞在人呼吸道中常见， 但在小鼠中少见等。 虽然肺 上皮细胞系能够表现出人类肺组织的一些表性特征， 但这些细胞系只能单层培养， 并且很 难通过其进一步了解肺组织发育和形成过程的影响因素， 如上皮 ‑间充质相互作用和分支 形态发生等[17]。 因此， 建立能够还原人体环境的体外模型是准确研究人肺发育和疾病病程 的关键。 [0005]目前， 在寻找哮喘和肺囊性纤维化等疾病的新疗法以及内源性修复在慢性阻塞性 肺病、 肺气肿、 家族性和特发性肺纤维化和闭塞性细支气管炎综合征等疾病中作用的研究 方面， PDLO具有很大 的应用前景[18,19]。 但在呼吸系统细菌性感染疾病的领域中， 却很少见 到应用PDLO的研究报道。 既往的研究中， 为了能够控制感染类器官的病原体数量从而得到 固定的感染复数(multiplicity of  infection， MOI)， 同时观察感染类器官与免疫细胞之 间的相互作用， 制备的类器官感染模型则采用将定量的衣原体显微注射入 单个子宫内膜类说　明　书 1/9 页 3 CN 115011548 A 3