(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210598849.8 (22)申请日 2022.05.30 (83)生物保 藏信息 CCTCC No. M 202 2210 2022.03.07 (71)申请人 四川大学 地址 610000 四川省成 都市一环路南 一段 24号 (72)发明人 高鸿　李雨萌　吴艳萍　钟凯　 黄毅娜　 (74)专利代理 机构 成都欣圣知识产权代理有限 公司 512 92 专利代理师 王海文 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12N 1/04(2006.01)A23L 29/00(2016.01) A23L 19/20(2016.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 耐乙醇片球菌及其活化方法、 菌剂及其制备 方法和应用 (57)摘要 本发明公开了一种耐乙醇片球菌及其活化 方法、 菌剂及其制备方法和应用， 该耐乙醇片球 菌 （Pediococcus ethanolidurans ） M1117保藏在 中国典型培养物保藏中心， 保藏编号为： CCTCC   No.M 2022210。 该 耐乙醇片球菌M1117采用MRS培 养基， 于30~45℃条件下培养活化， 其活性较好且 生长较快， 可制作发酵直投式菌剂。 该菌剂为耐 乙醇片球菌M1117的菌体与冻干保护剂通过真空 冷冻干燥制得， 能应用于泡菜的制备。 泡菜的制 备方法是以辣椒为原料， 添加辅料， 并接种菌剂， 进行密封发酵， 得到低亚硝酸盐泡菜。 该方法改 善了泡菜的色泽和风味， 缩短了发酵时间， 发酵 过程中亚硝酸盐含量均低于2mg/ Kg， 提高了泡菜 食用的安全性。 权利要求书1页 说明书7页 附图7页 CN 114752539 A 2022.07.15 CN 114752539 A 1.一种耐乙醇片球菌 （ Pediococcus  ethanolidurans ） M1117， 其保藏在中国典型培养 物保藏中心， 保藏编号 为： CCTCC No. M 2022210。 2.一种如权利要求1所述耐乙醇片球菌 M1117的活化方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 步骤S1. 将耐乙醇片球菌M1117采用划线法， 在MRS琼脂固体培养基上接种， 并在30~45 ℃条件下， 于恒温培 养箱中培 养36~48h， 获得 单菌落； 步骤S2. 将单菌落接种在MRS肉汤培养基中， 于30~45℃、 100~220r/min条件下， 振荡培 养18~36h， 活化， 得到耐乙醇片球菌 M1117培养液。 3.一种菌剂， 其特 征在于， 所述菌剂包 含权利要求1所述的耐乙醇片球菌 M1117。 4.一种如权利要求3所述菌剂的制备 方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 步骤S1. 将耐乙醇片球菌M1117培养液在  6000~15000 r/min、 4℃条件下， 离心10~20  min， 弃上清液， 收集菌体； 步骤S2. 在菌体中加入冻干保护剂， 混合均匀， 置于 ‑25~‑15℃预冻10~24h， 然后真空 冷冻干燥， 得到直投式菌剂。 5.根据权利要求4所述的菌剂的制备方法， 其特征在于， 所述步骤S1中， 所述耐乙醇片 球菌M1117培养液的浓度为107 ~109CFU/mL。 6.根据权利要求4所述的菌剂的制备方法， 其特征在于， 所述步骤S2中， 所述冻干保护 剂以质量分数计， 包括： 5~10%脱脂乳粉、 3~8%海藻糖、 3~8%蔗糖、 2~5%甘油， 余量为水。 7.根据权利要求4所述的菌剂的制备方法， 其特征在于， 所述步骤S2中， 所述菌体与冻 干保护剂的质量体积比为1:3~8。 8.根据权利要求3所述的菌剂在泡菜中的应用。 9.一种泡菜的制备 方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 步骤S1. 取无病虫害的新鲜辣椒， 洗净、 自然风干， 备用； 步骤S2. 将玻璃坛用沸水灭菌10~30min， 然后加入冷却开水， 再加入5~10g/L冰糖和50 ~70g/L泡菜盐； 步骤S3. 待冰糖、 泡菜盐溶解后， 依次加入10~50g/L生姜、 10~50g/L大蒜和1~3g/L花 椒， 得到泡菜卤水； 步骤S4. 在无菌超净工作台里， 将菌剂接种到泡菜卤水中； 步骤S5. 将辣椒以质量比1:3~5放入泡菜卤水中， 再加入泡菜卤水体积分数1~3%的白 酒； 步骤S6. 将玻璃坛放置于20~30℃恒温培养箱中， 连续密封发酵8~15天， 得到低亚硝酸 盐泡菜。 10.根据权利要求9所述的泡菜的制备方法， 其特征在于， 所述步骤S4中， 所述菌剂的接 种量为辣椒重量的1~3%。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114752539 A 2耐乙醇片球菌及其活化方 法、 菌剂及其制备方 法和应用 技术领域 [0001]本发明涉及微生物技术领域， 特别涉及一种耐乙醇片球菌及其活化方法、 菌剂及 其制备方法和应用。 背景技术 [0002]泡菜是一种传统的发酵蔬菜制品， 泡菜以新鲜蔬菜等为主要原料， 添加或不添加 辅料， 经食用盐或食用盐水泡渍， 在厌氧条件下通过附着在蔬菜表 面的乳酸菌发酵， 调味或 不调味等工艺加工而成的蔬菜制品。 经过发酵作用， 不仅可以保留蔬菜本身的营养物质， 而 且使其更具有独特 的风味。 泡菜不仅能够提高人们的食欲， 还能在发酵的过程中产生对人 体有益的乳酸菌， 抑制肠道中腐败菌的生长， 促进人体的消化。 [0003]但是， 泡菜在腌制过程中会产生对人体健康不利的亚硝酸盐， 他们主要来自于蔬 菜中含量较高的硝酸盐。 蔬菜吸收氮肥或土壤中的氮素， 积累无毒的硝酸盐， 在腌制过程中 硝酸盐被一些亚硝酸盐还原细菌转变成亚硝酸盐， 从而产生毒性。 泡菜中亚硝酸盐的危害 主要有： （1） 亚硝酸盐进入血液后可与血红蛋白结合， 使血红蛋白氧化变为高铁血红蛋白， 从而失去携氧能力， 导致组织缺氧； （2） 亚硝酸盐极易与胺合成N ‑亚硝胺， 亚硝胺是一种 致 癌物质。 因此在泡菜的腌制过程中如果产生过多亚硝酸盐会不利于人们的健康， 存在食品 安全问题。 所以找到一种有效降低泡菜中亚硝酸盐含量的方法至关重要。 [0004]传统泡菜依靠蔬菜原料表面的微生物在自然条件下发酵而 成， 但自然发酵泡菜中 微生物种类复杂多样， 泡菜质量不稳定难以进行工业化生产。 目前市场上对泡菜发酵剂的 需求越来越高， 利用发酵剂可以缩短发酵周期， 获得较为稳定的质量。 泡菜中的优势菌种在 发酵过程中发挥了主导作用， 利用优势菌种作为发酵剂制备风味优良的泡菜， 是当前市场 需求的趋势所在。 发明内容 [0005]基于此， 本申请从川南传统洞藏泡菜水中分离出来一种菌株， 经分子生物学、 系统 进化分析和形态学分析鉴定为耐乙醇片球菌， 命名为 Pediococcus  ethanolidurans   M1117， 其16S  rRNA序列已存入NCBI数据库， GenBank登录号为ON102795， 该菌种于2022年3 月7日保藏在中国典型培养物保藏中心 （CCTCC） ， 详细地址为湖北省武汉市武昌区八一路珞 珈山， 保藏编号 为CCTCC No. M 2022210。 [0006]本申请还提供了一种所述耐乙醇片球菌 M1117的活化方法， 包括以下步骤： 步骤S1. 将耐乙醇片球菌M1117采用划线法， 在MRS琼脂固体培养基上接种， 并在 30~45℃条件下， 于恒温培 养箱中培 养36~48h， 获得 单菌落； 步骤S2. 将单菌落接种在MRS肉汤培养基中， 于30~45℃、 100~220r/min条件下， 振 荡培养18~36h， 活化， 得到耐乙醇片球菌 M1117培养液。 [0007]本申请还提供了一种菌剂， 所述菌剂包 含所述的耐乙醇片球菌 M1117。 [0008]本申请还提供了所述菌剂的制备 方法， 包括以下步骤：说　明　书 1/7 页 3 CN 114752539 A 3