(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210686467.0 (22)申请日 2022.06.17 (71)申请人 天津大学 地址 300350 天津市津南区海河教育园雅 观路135号天津大 学北洋园校区 (72)发明人 陈磊　解亚茹　孙韬　张卫文　 (74)专利代理 机构 天津市北洋 有限责任专利代 理事务所 12 201 专利代理师 陆艺 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12N 1/36(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 能够耐受高光强的集胞藻驯化菌株的驯化 方法 (57)摘要 本发明公开了一种获得耐受高光强集胞藻 菌株的定向驯化方法， 步骤： 确定集胞藻野生型 菌株的初始敏感光照强度； 在培养基中接种集胞 藻野生型菌液使酶标仪测定OD750nm为0.04， 在初 始敏感光照强度下， 培养至平台期； 转接入培养 基， 继续驯化， 以此连续传代培养至集胞藻在平 台期的酶标仪测定OD750nm≥0.8； 逐步提高光照 条件， 继续驯化， 以此连续传代培养至光照强度 到2000μmol光子m‑2s‑1时集胞藻在平台期 的酶 标仪测定OD750nm≥0.8， 本发明获得的驯化菌株 能在2000μmol光子m‑2s‑1高光条件下生长7天： OD750nm、 叶绿素a、 类胡萝卜素、 干重和糖原含量 高于野生型菌 株。 权利要求书1页 说明书3页 附图2页 CN 114854648 A 2022.08.05 CN 114854648 A 1.能够耐受高光强的集胞藻驯化菌株的驯化方法， 其特 征是包括如下步骤： (1)通过体外敏感实验确定集胞藻野生型菌株的初始敏感光照强度； (2)在液体BG11培养基中接种集胞藻野生型菌液使酶标仪测定OD750nm为0.04， 在初始 敏 感光照强度下， 培 养至平台期； (3)将步骤(2)培养至平台期的细 胞转接入液体BG11培养基， 在初始敏感光照强度下继 续驯化， 以此 连续传代培 养至集胞藻在平台期的酶标仪测定OD750nm大于或等于 0.8； (4)逐步提高光照条件， 继续驯化， 以此连续传代 培养至光照强度到2 000 μmol光子m‑2s‑1 时集胞藻在平台期的酶标仪测定OD750nm大于或等于0.8， 得到能够耐受高光强的集胞藻驯化 菌株。 2.根据权利要求1所述的驯化方法， 其特 征在于所述菌种为 集胞藻PC C 6803。 3.根据权利要求1所述的驯化方法， 其特征在于所述逐步提高光照条件为光照强度从 初始敏感光照强度至20 00 μmol光子m‑2s‑1。 4.根据权利要求1或3所述的驯化方法， 其特征在于所述初始敏感光照强度为100μmol 光子m‑2s‑1。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114854648 A 2能够耐受高光强的集胞藻驯化 菌株的驯化方 法 技术领域 [0001]本发明属于工业微生物领域， 具体涉及能够耐受高光强的集胞藻驯化菌株的驯化 方法。 背景技术 [0002]化石燃料是不可再生的资源， 过多使用会释放大量的温室气体到大气中， 导致全 球变暖。 因此， 探索可再生和绿色的生物 能源以替代传统的化石能源并减轻环境污染是我 们迫切需要解决的问题。 经由光合作用， 每年约2580亿 吨CO2被固定为有机物， 而这其中陆 地植物贡献约为30％， 其余70％由海洋光合微生物贡献。 其中， 蓝细菌是唯一可以进 行光合 作用并释放氧气的原核生物， 其可贡献全球固碳总量的25％左右。 除了作为初始生产者的 传统角色之外， 近几十年来， 借助先进的合成生物学技术， 蓝细菌已被成功地改造为 “光驱 动细胞工厂 ”， 可直接利用二氧化碳生产数十种可再生燃料和化学物质， 包括乙醇、 丁醇、 丁 二醇、 丙二醇、 丙酮、 蔗糖、 柠檬烯和3 ‑羟基丙酸等。 以上研究充分证明了基于光合蓝细菌开 发可持续生产系统的可行性。 其中模式蓝细菌集胞藻PCC  6803是蓝藻门、 集胞藻属， 繁殖方 式为二分裂形式的一种单细胞非固氮球形蓝藻， 在1968年首次从淡水湖中分离得到。 作为 模式菌株， 集胞藻6803的全基因组测序在1996年已经完成， 其基因组全长为3573kb， GC含量 为47.7％， 约含3264个蛋白编码基因。 [0003]光作为蓝细菌进行光合作用的能量来源， 在蓝细菌 的生长过程中是必不可少的。 但是， 早期 研究表明， 过多的光能会破坏蓝细菌的能量供应和消耗之 间的平衡， 从而导致细 胞内的毒性活性氧(ROS)积累， 包括过氧化氢(H2O2)、 超氧阴离子(O2‑)、 羟基自由基(OH ·) 和单线态氧(1O2)。 过多的ROS进一步破坏其他关键细胞成分， 如核酸、 脂质、 色素和蛋白质， 最终导致细胞死亡。 具体来说， 光合作用可以被认为是一系列有序的氧化还原反应。 当光能 供应等于消耗时， 光合作用的氧化还原平衡得以维持， 但当收集过多的光时， 平衡将被破 坏， 从而导致电子传递链的过度还原。 此外， 光系统II比光系统I更容易受到高光强度的影 响， 高光对光系统II反应中心极易产生光损伤。 而高光造成的光损伤无疑将会限制蓝细菌 的光合作用效率及碳固定能力。 另外， 为了具有成本效益， 蓝细菌的工业或大规模培养必须 基于户外培养利用天然太阳能。 对于户外培养， 保持持续光照成本很高， 而且蓝细菌在自然 界中不可避免地遭受高光胁迫。 在自然环境中， 太阳光最强可达2000μmol光子m‑2s‑1， 对细 胞造成严重的损伤并大大降低其光合效率。 因此， 为了促进高效光合细胞工厂的建设及其 工业应用， 构建高光耐受底盘以及解析蓝细菌的高光耐受机制是我们亟 待解决的问题。 发明内容 [0004]本发明的目的是克服现有技术的不足， 提供能够耐受高光强的集胞藻驯化菌株的 驯化方法。 [0005]本发明的技 术方案概 述如下： [0006]能够耐受高光强的集胞藻驯化菌株的驯化方法， 包括如下步骤：说　明　书 1/3 页 3 CN 114854648 A 3