(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210590972.5 (22)申请日 2022.05.27 (71)申请人 华东理工大 学 地址 200237 上海市徐汇区梅陇路13 0号 (72)发明人 高淑红　贾佳　徐可心　张宪花　 刘崎宇　 (74)专利代理 机构 上海智信专利代理有限公司 31002 专利代理师 吴林松 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12N 1/02(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) C12P 19/62(2006.01) C12R 1/465(2006.01) (54)发明名称 螺旋霉素高产菌 株及其筛 选方法 (57)摘要 本申请公开了一种螺旋霉素高产菌株及其 筛选方法。 通过平板培养筛选螺旋霉素高产菌株 的方法包括： 将生二素链霉菌的孢子悬浮液或菌 丝体培养物， 进行梯度稀释后涂于含有N ‑乙酰葡 萄糖胺的平板培养基中进行恒温培养， 获得单菌 落。 对所获得的菌落进行形态学筛选， 挑选气生 菌丝发育良好， 菌丝能够产孢的菌落进行发酵培 养， 从中获得螺旋霉素高产菌株。 利用本发明所 述的方法进行菌种筛选， 获得的菌株螺旋霉素产 量高， 且具有很高的传代稳定性。 所述方法简便 快捷， 成本低廉， 适用于 工业化生产。 权利要求书2页 说明书15页 附图11页 CN 114908015 A 2022.08.16 CN 114908015 A 1.一种螺旋霉素高产菌株的筛选方法， 其特征在于， 其包括如下步骤： 将螺旋霉素生产 菌株生二素链霉菌进 行稀释分离， 将分散的生二素链霉菌菌液涂于含有不同浓度N ‑乙酰葡 萄糖胺(GlcNAc)的平板培养基中， 调整稀释梯度， 获得能够分离的单菌落培养平板进行培 养， 挑选气生菌 丝能够产孢的菌落进行斜 面培养和发酵培 养， 从中获得螺 旋霉素高产菌株。 2.根据权利要求1所述的筛选方法， 其特征在于， 螺旋霉素生产菌株为生二素链霉菌 Streptomyces  ambofaciens； 制备的生二素链霉菌菌液是单孢子悬浮液， 或经过活化培养 的菌丝体培养物。 3.根据权利要求1所述的筛选方法， 所述平板培养基包括： 黄豆饼粉20 ‑60g/L、 葡萄糖 20‑60g/L、 七水硫酸镁0.5 ‑1.5g/L、 琼脂粉10 ‑30g/L； 筛选平板培养基中加入的N ‑乙酰葡萄 糖胺的浓度为5 ‑40g/L； 和/或， 所述培 养的温度为28 ±2℃； 培养的时间为7至10天。 4.根据权利要求1所述的筛 选方法， 其特 征在于， 斜面培养的温度为28 ±2℃； 培养的时间为7至10天； 和/或， 螺旋霉素生产菌株生二素链霉菌在稀释分离前经过种子培养： 于摇床中震荡培 养46至48h， 摇床的温度为28 ±1℃， 得到种子 培养液， 对种子 培养液进行稀释分离； 和/或， 发酵培养于摇床中震荡培养6至10天， 摇床的温度为28 ±1℃， 得到所述发酵液； 并进行螺 旋霉素效价测定 。 5.根据权利要求 4所述的发酵培 养方法， 其特 征在于， 所述斜面培养基包括： 黄豆饼粉20 ‑60g/L、 葡萄糖20 ‑60g/L、 七水硫酸镁0.5 ‑1.5g/L、 琼脂粉10 ‑30g/L； 所述种子培养基包括： 糊精30 ‑80g/L、 黄豆饼粉5 ‑15g/L、 玉米浆5 ‑20g/L、 碳酸钙2 ‑8g/ L， pH为6.6 ‑6.8。 所述发酵培养基包括： 糊精30 ‑80g/L、 酵母粉1.5 ‑3.5g/L、 玉米浆15 ‑25g/L、 豆油10 ‑ 30g/L、 磷 酸二氢钾2 ‑6g/L、 氯化钠2 ‑4g/L、 氯化钾2 ‑6g/L、 葡萄糖10 ‑14g/L、 硫 酸铵1‑3g/L、 硫酸锌0.5 ‑1.5g/L、 硫酸镁0.5 ‑1.5g/L、 氯化钴0.2 ‑0.4g/L、 碳酸钙10 ‑18g/L， pH为6.6 ‑ 6.8。 6.根据权利要求 4所述的效价测定方法， 其特 征在于， 所述螺旋霉素效价测定包括如下步骤： 将每个发酵液多次离心后取上清液， 用流动相 稀释所述上清液， 过滤得到滤液， 将所述滤液作为上样液进 行色谱检测， 根据色谱检测结果 并比照外标计算出每 个上样液中螺 旋霉素的效价； 所述色谱检测的条件包括： 色谱柱： ZORBAX  SB‑C8色谱柱， 250mm ×4.6mm， 5 μm； 流动相： pH＝2.2的9.3g/L高氯酸钠磷酸盐缓冲液： 乙腈＝7： 3； 检测条件： 柱温为30℃； 紫外检测 波 长为232nm； 流速为1mL/mi n； 进样量 为20 μL。 7.根据权利要求4所述的筛选方法， 其特征在于， 螺旋霉素高产菌株通过筛选获得： 将 多个菌落分别进 行多次连续传代发酵培养， 并对每次传代培养后的菌种进 行螺旋霉素效价 测定， 比较同一个菌落每代的螺旋霉素效价测定结果， 选择每代的螺旋霉素效价测定结果 均在20000U/mL以上的菌种； 所述连续传代培 养的代数至少为5次。 8.一种螺旋霉素高产菌株， 其特征在于， 其由如权利要求1至7中任意一项所述的筛选权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114908015 A 2方法筛选而成。 9.根据权利要求8所述的螺旋霉素高产菌株， 其特征在于， 与螺旋霉素生产菌株生二素 链霉菌相比， 螺旋霉素高产菌株的dasR基因转录水平下降0.9 倍， 螺旋霉素生物 合成基因簇 中的调节基因srm25和srm40分别下调3.16和1.45倍。 10.如权利要求8所述的螺 旋霉素高产菌株在制备螺 旋霉素中的用途。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114908015 A 3