(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210925726.0 (22)申请日 2022.08.03 (71)申请人 华中农业大 学 地址 430000 湖北省武汉市洪山区狮子山 街1号 (72)发明人 孙学成　徐青云　胡承孝　谭启玲　 武松伟　张锐　秦晓明　郑小妹　 (74)专利代理 机构 合肥初云专利代理事务所 (普通合伙) 34273 专利代理师 徐冬 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12N 1/02(2006.01) A01G 22/15(2018.01) A01G 7/06(2006.01)A01N 63/27(2020.01) A01P 21/00(2006.01) C12R 1/38(2006.01) (54)发明名称 解磷假单胞菌PSB-26及其筛选方法和在小 白菜上的应用 (57)摘要 本发明公开了解磷假单胞菌PSB ‑26， 筛选自 湖北大峪口磷尾矿区植物根际土壤中的菌株， 通 过16S rDNA序列分析， 通过NCBI数据库进行比 对， 确定该菌株为假单胞菌。 本发明利用无机磷 培养基从磷尾矿区植物根际土壤中筛选出一株 高效解磷菌株， 解磷量在 9d达到52 6mg/L， 将其制 成菌液， 通过盆栽实验施用到小白菜中， 能够显 著提高土壤中速效磷含量、 小白菜产量及促进小 白菜光合作用， 本发明中的假单胞菌具有易繁 殖， 解磷能力强等优点， 具有良好的应用前 景。 权利要求书1页 说明书4页 附图3页 CN 115261272 A 2022.11.01 CN 115261272 A 1.解磷假单胞菌PSB ‑26， 其特征在于， 筛选自湖北大峪口磷尾矿区植物根际土壤中的 菌株， 通过16S  rDNA序列分析， 通过NCBI数据库进行比对， 确定该菌株为 假单胞菌。 2.如权利要求1所述的解磷假单 胞菌PSB‑26的筛选方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： S1、 解磷菌株的筛 选、 分离纯化： 称取1g磷尾矿区根际土壤样品于已经灭菌的锥 形瓶中， 加入99ml无菌水， 配制成10‑2悬 浊液， 置于25℃， 180r/min的摇床中， 震荡30min后取出， 表面喷洒75％酒精消 毒后， 放入超 净工作台， 将其逐级稀释为10‑3、 10‑4、 10‑5悬浊液， 分别吸取100 μL不同浓度菌液， 加入到难 溶性无机磷固体培养基中， 用三角涂布棒将其均匀 地涂抹于无机磷固体培养基中， 每个浓 度做三个平行， 置于30℃恒温培养箱中培养5 ‑7d， 观察菌落生长情况， 将具有 溶磷圈的菌落 重新在LB固体培养基上平板划线进 行纯化以得到单一菌株， 将纯化得到的菌株保存于含有 30％甘油的LB液体培 养基中， 于 ‑80℃中保存； S2、 解磷能力检测： 制备无机磷液体培养基， 将菌株于LB液体培养基中进行活化， 待OD  600至0.8 ‑1.0之间 时， 按照1％的接菌量接种于无机磷 液体培养基中， 在30℃， 180r/min下培养， 分别在第0、 3、 6、 9d取样， 10 000r/min离心10mi n后测定上清液中无机磷 含量。 3.根据权利 要求2所述的解磷假单胞菌PSB ‑26的筛选方法， 其特征在于， 所述S1中的磷 尾矿区地理位置为： 北纬31 °27′11″， 东经112°15′21″。 4.根据权利 要求2所述的解磷假单胞菌PSB ‑26的筛选方法， 其特征在于， 所述LB液体培 养基由以下质量分数配比的组份构成： 胰 蛋白胨10.0g， 酵母浸粉5.0g， 氯化钠 10.0g， pH值 7.0±0.1， 蒸馏水10 00ml； 所述LB固体培养基由以下质量分数配比的组份构成： 每升LB 液体培养基添加15 ‑20g琼 脂粉。 5.根据权利 要求2所述的解磷假单胞菌PSB ‑26的筛选方法， 其特征在于： 所述无机磷液 体培养基由以下质量分数配比的组份构成： 葡萄糖10.0g， 硫酸铵0.5g， 酵母浸粉0.5g， 氯化 钠0.3g， 氯化钾0.3g， 硫酸镁0.3g， 硫酸亚铁0.03g， 硫酸锰0.03， 磷酸三钙5.0g， 蒸馏水 1000ml； 所述无机磷固体培养基由以下质量分数配比的组份构成： 每升LB无机磷固体培养基添 加15‑20g琼脂粉。 6.根据权利 要求5所述的解磷假单胞菌PSB ‑26的筛选方法， 其特征在于， 所述无机磷液 体培养基pH值 为7.0‑7.5。 7.根据权利要求4或5所述的解磷假单胞菌PSB ‑26的筛选方法， 其特征在于， 所述LB液 体培养基、 LB固体培养基、 无机磷 液体培养基和无机磷固体培养基在高压灭菌锅中121℃灭 菌15min备用， 所述 LB固体培 养基与无机磷固体培 养基被制成平板 培养基。 8.如权利 要求2所述的解磷假单胞菌PSB ‑26在小白菜上的应用， 其特征在于， 包括以下 步骤： 使用无菌水将S2中活化后菌液浓度稀释至1.5 ×107CFU/ml， 在小白菜生长至两叶一心 后， 通过灌根法施于小白菜中， 每盆施用量为100ml， 使土壤中最终菌液浓度为1.0 × 106CFU/g。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115261272 A 2解磷假单胞菌PSB ‑26及其筛选方 法和在小白菜上的应用 技术领域 [0001]本发明涉及解磷微生物肥料技术领域， 尤其涉及解磷假单胞菌PSB ‑26及其筛选方 法和在小白菜上的应用。 背景技术 [0002]磷是植物必需的营养元素之一， 参与植物体内多种代谢过程。 而土壤中的磷大部 分不能被作物吸收利用， 施入土壤的磷肥只有5 ‑25％的利用率， 大部分磷肥被固定成为植 物难以吸 收利用的磷， 因此， 活化土壤中的难溶性磷可以减少磷肥的投入， 具有重要意 义。 [0003]解磷菌可以通过分泌质子、 有机酸等方式将土壤中的难溶性磷溶解为可溶性磷， 同时分泌磷酸酶等其他酶将有机磷矿化成无机磷， 供作物吸收利用。 因此利用解磷菌的微 生物作用来 提高磷的利用率是现在研究的热点。 发明内容 [0004]本发明针对现有问题而提供解磷假单胞菌PSB ‑26及其筛选方法和在小白菜上的 应用， 从磷尾矿区植物根际土壤中筛选出一种 具有解磷功 能的假单胞菌， 来解决土壤中大 量磷不能被植物直接吸收利用的问题， 并将其应用至小白菜。 本发明中具有解磷功 能的假 单胞菌不仅可以提高土壤中速效磷含量， 而且在提高小白菜生物量， 促进光合作用， 改善内 在品质上都具有重要的现实意 义。 [0005]为了实现上述目的， 本发明采用了如下技 术方案： [0006]解磷假单胞菌PSB ‑26， 筛选自湖北大峪口磷尾矿区植物根际土壤中的菌株， 通过 16S rDNA序列分析， 通过NCBI数据库进行比对， 确定该菌株为 假单胞菌。 [0007]解磷假单 胞菌PSB‑26的筛选方法， 包括以下步骤： [0008]S1、 解磷菌株的筛选、 分离纯化： 称取1g磷尾矿区根际土壤样品于已经灭菌的锥形 瓶中， 加入99ml无菌水， 配制成10‑2悬浊液， 置于25℃， 180r/min的摇床中， 震荡30min后取 出， 表面喷洒75％酒精消 毒后， 放入超净工作台， 将其逐级稀释为10‑3、 10‑4、 10‑5悬浊液， 分 别吸取100 μL不同浓度菌液， 加入到难 溶性无机磷固体培养基中， 用三角涂布 棒将其均匀地 涂抹于无机磷固体培养基中， 每个浓度 做三个平行， 置于30℃恒温培养箱中培养5 ‑7d， 观察 菌落生长情况， 将具有 溶磷圈的菌落重新在LB固体培养基上平板划线进 行纯化以得到单一 菌株， 将纯化得到的菌株 保存于含有30％甘油的LB液体培养基中， 于 ‑80℃中保存； S2、 解磷 能力检测： 制备无机磷液体培养基， 将菌株于LB液体培养基中进行活化， 待OD  600至0.8 ‑ 1.0之间时， 按照1％的接菌量接种于无机磷液体培养基中， 在30℃， 180r/min下培养， 分别 在第0、 3、 6、 9d取样， 10 000r/min离心10mi n后测定上清液中无机磷 含量。 [0009]优选地， 所述S1中的磷尾矿区地理位置为： 北纬31 °27′11″， 东经112°15′21″。 [0010]优选地， 所述LB液体培养基由以下质量分数配比的组份构成： 胰蛋白胨10.0g， 酵 母浸粉5.0g， 氯化钠10.0g， pH值7.0 ±0.1， 蒸馏水1000ml； 所述LB固体培养基由以下质量分 数配比的组份构成： 每升LB液体培 养基添加15 ‑20g琼脂粉。说　明　书 1/4 页 3 CN 115261272 A 3