(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210811343.0 (22)申请日 2022.07.11 (83)生物保 藏信息 CGMCC No.24700 2022.04.18 (71)申请人 澄江老仓醋食品科技有限公司 地址 652500 云南省玉 溪市澄江市工业园 区蛟龙潭片区 （昊海蓝 莓旁） (72)发明人 何二平　赵祖艳　董霞　吴荣书　 (74)专利代理 机构 昆明今威专利商标代理有限 公司 53115 专利代理师 赛晓刚 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12N 1/04(2006.01) C12J 1/04(2006.01)C12R 1/02(2006.01) (54)发明名称 醋化醋杆菌及获取方法、 复合冻干发酵剂的 制备方法及其在制醋中的应用 (57)摘要 本发明公开了醋化醋杆菌及获取方法、 复合 冻干发酵剂的制备方法及其在制醋中的应用， 通 过以云南老仓醋为原料， 在单因素 实验基础上筛 选出优势菌株醋化醋杆菌(Acetobacter   aceti)， 采用响应面法优 化确定老仓醋醋酸发酵 条件的最佳制备工艺参数， 优化筛选出醋化醋杆 菌冻干复合保护剂； 制备出较高活性的醋化醋杆 菌复合冻干发酵剂菌粉， 与实验室制备复合冻干 酵母菌复合冻干发酵剂联用并初步应用于实验 室小规模生产云南老仓醋， 对缩短老仓醋生产过 程周期， 提高老仓醋产品稳定性具有重要的意 义。 权利要求书2页 说明书19页 附图9页 CN 115141774 A 2022.10.04 CN 115141774 A 1.一种醋化醋杆菌 ， 其特征在于 ， 该菌株为云南老仓醋优势菌醋化醋杆菌 (Acetobacter  aceti)， 于2022年04月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心， 保藏编号 为CGMCC No.24700。 2.一种醋化醋杆菌的获取 方法， 其特 征在于， 所述获取步骤 包括： S1： 采样， 取云南老仓醋发酵池内醋化阶段13 ‑25天醋液低温保藏； S2： 制备菌悬液： 称取1g醋样品倒入15mL灭过菌的离心管中， 加入9mL无菌水， 振荡5～ 10min， 使样品充分 分散， 即配制10‑1浓度的悬 液； S3： 稀释： 将1mL  10‑1悬液用无菌移液枪吸入含有9mL无菌水的离心管中， 即为10‑2的样 品稀释液， 重复此 过程可依次制成10‑3、 10‑4、 10‑5、 10‑6的稀释液； S4： 使用酵母膏1％、 葡萄糖1％、 琼脂2％配制培养基， 采用倾注法， 在倾注前加入碳酸 钙2％和无水乙醇4％， 待平 皿凝固后倒置于35℃恒温培养箱培养， 72h后记录稀释倍数和相 应的菌落数量； S5： 分离纯化， 挑取醋化醋杆菌平板上典型的菌落， 划线后 30℃倒置培养72h， 挑取单个 菌落， 进行菌落特征观察、 革兰氏染色、 显微镜细胞形态观察以及醋化醋杆菌定性试验； 挑 选出革兰氏染色阴性， 能与FeCl3溶液形成红褐色沉淀者， 将菌株进行平板划线纯分离， 最 后将纯分离 菌株转接斜 面固体培 养基上， 培 养后放于4℃冰箱中保藏； S6： 筛选， 将活化好的醋化醋杆菌菌株接种于基础液体培养基中， 30℃静止培养48h制 成醋化醋杆菌种子液， 吸取2％醋化醋杆菌种子液至100mL液体发酵培养基中， 30℃条件下 静置培养， 每隔24h测定一次产酸量， 连续测定10天， 每个菌株测三组平行， 确定菌株的产酸 能力， 根据其试验结果绘制产酸 量曲线， 筛 选出醋化醋杆菌株。 3.一种利用权利要求1所述的一种醋化醋杆菌制备复合冻干发酵剂的方法， 其特征在 于， 所述制备步骤 包括： 步骤一， 菌株种子液的制备： 从菌种保藏斜面上挑取少量醋化醋杆菌菌株接种于基础 培养基中， 3 0℃、 静止 培养48h制成醋化醋杆菌 菌种子液； 步骤二， 菌种复配， 醋化醋杆菌接种量为1.0％， 酿醋菌接种量为0.03 ％， 接种于培养基 中发酵9d得到复配菌种。 步骤三,菌体离心收集： 在离心转速为5000r/min， 离心时间为20min， 离心温度为8℃条 件收集菌泥； 步骤四， 保护剂的制备： 所述保护剂包括奶粉和糖醇， 糖醇与脱脂奶粉比为1:1； 所述糖 醇包括甘露醇和乳糖， 所述乳糖与甘露醇比为1:1； 步骤五， 冻干： 按照菌泥与保护剂比例1:3真空冻干得到复合冻干发酵剂。 4.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于， 所述步骤1中培养基包括液体培养基和固 体培养基， 分别为： 液体培养基： 酵母 浸膏1％， 葡萄糖1％， 无 水乙醇4％； 固体培养基： 酵母 浸膏1％， 葡萄糖1％， 无 水乙醇4％， 琼脂2％， 碳 酸钙2％。 5.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于， 所述步骤三中的保护剂各成分及浓度为： 奶粉浓度14.314％、 甘露醇浓度2.831％， 乳糖浓度9.347％。 6.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于， 所述步骤五冻干时菌悬液的最大厚度为 0.75cm。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115141774 A 27.一种根据权利要求3所述的制备方法制备的一种醋化醋杆菌复合冻干发酵剂在制备 云南老仓醋中的应用。 8.一种根据权利要求3所述的方法制备的一种醋化醋杆菌复合冻干发酵剂联合酵母菌 复合冻干发酵剂在制备云南老仓醋中的应用。 9.根据权利要求8或者9所述的应用， 其特征在于， 所述醋化醋杆菌复合冻干发酵剂添 加量为1％。 10.根据权利要求8所述的应用， 其特 征在于， 具体步骤 包括： 1)酵母菌复合冻干发酵剂在马铃薯葡萄糖 水中活化2代， 调整菌浓度为3 ×106CFU/mL备 用； 2)云南老仓醋酒化阶段： 10公斤茶、 20公斤红糖， 加入到200公斤水， 煮开， 过滤、 冷却后 放入有老发酵液的土坛中， 将1)中菌液按照100： 1接入糖茶水中进行酒化阶段发酵， 密封发 酵6d天； 3)云南老仓醋醋化阶段： 步骤2)完成酒化阶段的发酵液中直接加入复合冻干发酵剂， 按照酒液： 复合冻干发酵剂为10 0:1的比例加入， 发酵9天。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115141774 A 3