(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210645875.1 (22)申请日 2022.06.08 (71)申请人 中国科学院青岛生物能源与过程研 究所 地址 266000 山东省青岛市崂山区松岭路 189号 (72)发明人 崔球　刘亚君　陈朝阳　宋晓金　 (74)专利代理 机构 山东康裕律师事务所 3731 1 专利代理师 傅培 (51)Int.Cl. C12P 19/02(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C12R 1/145(2006.01) (54)发明名称 采用氧气处理方法的木质纤维素全细胞糖 化技术 (57)摘要 本发明提供了采用氧气处理方法的木质纤 维素全细胞糖化技术， 包括以下步骤： （1） 对木质 纤维素原料进行预处理得到木质纤维素底物， 用 水清洗至中性。 （2） 在厌氧条件下， 将产纤维小体 菌株接种于种子培养基中， 一定温度和转速下培 养至对数生长中期， 得到种子 液。 （3） 将木质纤维 素底物转移至糖化培养基中， 通入 无氧空气置换 空气后， 灭菌。 接入种子液， 通入无菌空气， 使气 体层中的氧气含量达到0.2 ‑5% （v/v） 。 （4） 将糖化 体系在一定温度和转速预混合后， 一定温度和转 速下进行水解反应， 得到含有葡萄糖的糖液。 所 述糖化技术不但消除了木质纤维素全细胞糖化 技术对严格厌氧条件的需求， 而且实现了糖化周 期的显著缩短和糖得率的显著提高， 产生了不可 预料的技术效果。 权利要求书1页 说明书9页 CN 114807269 A 2022.07.29 CN 114807269 A 1.采用氧气处 理方法的木质纤维素全细胞糖化 技术， 其特征在于： 包括以下步骤： （1） 预处理： 对木质纤维素原料进行预处理， 得到木质素含量不 高于15%， 半纤维素含量 不高于20%的木质纤维素底 物， 然后用水清洗 至pH =7.0‑8.0； （2） 制备种子液： 在厌氧条件下， 将产纤维小体菌株接种于种子培养基中， 在55 ‑65℃的 温度条件和15 0‑250 rpm的转速条件下， 培 养至对数生长中期， 得到种子液； （3） 准备糖化体系： 将步骤 （1） 得到 的木质纤维素底物， 按照固液重量体积比1:2 ‑1:25 转移至糖化培养基中， 向体系气体层中通入 无氧空气 置换空气后， 进 行灭菌； 然后按照0.2 ‑ 1% (v/v)的低接种量接入步骤 （2） 获得的种子液， 随后向体系中通入 无菌空气， 使气体层中 的氧气含量达 到0.2‑5% （v/v） ； （4） 糖化： 将步骤 （3） 准备的糖化体系， 在55 ‑65℃的温度条件和80 ‑100rpm转速下预混 合0.5‑24小时， 然后在55 ‑65℃的温度条件和150 ‑250 rpm的转速条件下进行水解反应， 得 到含有葡萄糖的糖液， 直至糖化结束。 2.根据权利要求1所述的木质纤维素全细胞糖化技术， 其特征在于： 步骤 （3） 所述的无 氧空气中氧气浓度小于10 0 ppm； 所述灭菌的条件为1 15‑126℃， 30‑90分钟。 3.根据权利要求2所述的用于木质纤维素全细胞糖化的氧气处理方法， 其特征在于： 所 述的无氧空气优选纯氮气。 4.根据权利要求1 ‑3中任意一项所述的木质纤维素全细胞糖化技术， 其特征在于： 步骤 （2） 所述的产纤维小体菌株为表达葡萄糖苷酶的热纤梭菌 重组菌株。 5.根据权利要求4所述的木质纤维素全细胞糖化技术， 其特征在于： 步骤 （2） 所述的种 子培养基为： 磷酸氢二钾2.9  g/L、 磷酸二氢钾1.5  g/L、 硫酸铵1.1  g/L、 氯化钙0.1  g/L、 氯 化镁0.5g/L、 硫酸 亚铁0.5 mg/L、 硫化钠1  g/L、 玉米浆5 0 ml/L、 pH 7.5。 6.根据权利要求4所述的木质纤维素全细胞糖化技术， 其特征在于： 步骤 （3） 所述的糖 化培养基为： 磷酸氢二钾0.6  g/L、 磷酸二氢钾0.3  g/L、 硫酸铵1.1  g/L、 氯化钙0.1  g/L、 氯 化镁0.5g/L、 硫酸 亚铁0.5 mg/L、 硫化钠0.2  g/L、 玉米浆5 0 ml/L、 pH 7.5。 7.根据权利要求4所述的木质纤维素全细胞糖化技术， 其特征在于： 步骤 （1） 中所述的 木质纤维素原料为玉米秸秆、 麦秸、 柳枝 稷、 牧草和木糖渣。 8.根据权利要求4所述的木质纤维素全细胞糖化技术， 其特征在于： 步骤 （1） 中所述的 预处理为碱法、 氨水法、 或者磺化法。 9.根据权利要求4所述的木质纤维素全细胞糖化技术， 其特征在于： 步骤 （4） 采取并线 糖化的策略， 在水解反应的延滞阶段进行 下批木质纤维素底 物的预处 理和种子液的制备。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114807269 A 2采用氧气处理 方法的木质纤维素全细胞糖化 技术 技术领域 [0001]本发明属于生物技术领域， 涉及一种木质纤维素全细胞糖化的方法， 具体涉及一 种采用氧气处 理方法的木质纤维素全细胞糖化 技术。 背景技术 [0002]木质纤维素是自然界中储量最大的生物质原料， 实现木质纤维素到生物基化学品 和能源的高效生物转化， 不仅能可持续性地缓解日益严峻的化石能源危机， 还能有效地规 避农林废弃物不当处理造成的环境污染， 因此符合国家发展绿色循环经济的要求， 是实现 “双碳”目标的重要环节。 然而， 由于木质纤维素的结构和组成复杂， 生物转化的难度较大； 最大瓶颈莫过于纤维素结 晶区难降解、 导致酶解效率低， 导致生物转化的成本一直居高不 下。 为了实现木质纤维素的高效利用， 当务之急是实现木质纤维素底 物的高效水解糖化。 [0003]整合生物糖化是一种木质纤维素生物转化的新策略 ， 其采用热纤梭菌 (Clostridium  thermocellum或Acetivibrio  thermocellus)等可实现原位产酶的微生物 为高效全细胞催化剂， 以低成本发酵糖为目标产 物， 通过偶联下游发酵工艺， 极大的拓宽了 木质纤维素生物转化产品的品类和市场。 发明人前期的工作就是围绕整合生物糖化进行， 如发明专利ZL201810939181 .2、 ZL201810939517 .5、 ZL201810939518 .X、 ZL201810939182.7、 ZL201810939294.2、 ZL201810939170.4和ZL201810939296.1等公开了 利用整合生物糖化技术 实现木质纤维素到葡萄糖酸钠、 油脂类、 色素类、 生物燃料等产品的 转化。 [0004]目前， 木质纤维素全细胞糖化方案以热纤梭菌活细胞作为生物催化剂。 热纤梭菌 是严格厌氧菌， 通过生产胞外的纤维小体实现木质纤维素底物的高效降解。 由于热纤梭菌 的生长条件要求， 以及 纤维小体对氧气的敏感性， 本领域研究人员通常认为有氧气存在会 导致糖化效率降低。 例如， 存在0.8％的氧气就会使基于纤维小体的糖化效率显著降低 (Chen C,Qi K,Chi F,Song X,Feng Y,Cui Q,et al.Int J Biol Macromol  2022,207: 784‑790.)。 因此， 木质纤维素全细胞糖化需要采用严格厌 氧的培养条件和糖化条件。 然而， 对于大规模的工业化生产来说， 保证体系的严格厌氧通常存在非常大 的挑战。 为了实现严 格的厌氧条件， 往往需要在培养体系中加入半胱氨酸或硫化钠等还原性化合物， 从而显著 提高了成本 。 [0005]因此， 开发更加鲁棒、 简单的木质纤维素全细胞糖化技术， 在不降低糖化效率的同 时， 降低生产过程成本， 对大规模工业 化生产而言具有非常重要的意 义。 发明内容 [0006]基于现有技术中对降低木质纤维素全细胞糖化过程中严格厌氧条件的技术需求， 本发明提供了一种基于氧气 胁迫的全细胞催化剂接种与糖化方法， 不但消除了木质纤维素 全细胞糖化技术对严格厌氧条件的需求， 而且实现了糖化周期的显著缩短和糖得率的显著 提高， 产生了不可 预料的技术效果。说　明　书 1/9 页 3 CN 114807269 A 3