(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211030405.0 (22)申请日 2022.08.26 (71)申请人 扬州大学 地址 225009 江苏省扬州市大 学南路88号 (72)发明人 张清霞　熊正文　宋晓雅　杨晶龙　 孙丽　 (74)专利代理 机构 扬州苏中专利事务所(普通 合伙) 32222 专利代理师 许必元 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) A01N 63/27(2020.01) A01P 3/00(2006.01) C12R 1/38(2006.01) (54)发明名称 防御假单胞菌FD6发酵培养基及培养条件优 化方法 (57)摘要 本发明提供了一种防御假单胞菌FD6发酵培 养基及培养条件优化方法， 涉及细菌发酵技术领 域， 能够有效提高防御假单胞菌FD6无菌上清滤 液对番茄灰霉病菌的抑制率； 该培养基含有碳 源、 氮源和无机盐； 其中碳源为甘油、 氮源为精氨 酸、 无机盐含有K2HPO4和MgSO4·7H2O； 甘油添加 量为5‰、 精氨酸添加量为1.98 ‰、 无机盐添加量 为4‰； 发酵的培养条件为： 初始pH值为6.97、 装 液量为100  mL/L、 转速为200  r/min、 温度为 24.12℃、 发酵时间为60  h。 本发明提供的技术方 案适用于防御假单胞菌FD6的发酵 过程。 权利要求书1页 说明书9页 附图12页 CN 115353996 A 2022.11.18 CN 115353996 A 1.一种防御假单胞菌FD6发酵培养基， 其特征在于， 所述培养基含有碳源、 氮源和无机 盐； 其中碳源为甘油， 氮源为精 氨酸， 无机盐中含有K2HPO4和MgSO4·7H2O。 2.根据权利要求1所述的一种防御假单胞菌FD6发酵培养基， 其特征在于， 所述培养基 中甘油、 精氨酸、 无机 盐的量分别为： 甘油添加量为培养基总质量的5 ‰， 精氨酸添加量为培 养基总质量的1.98 ‰， 无机盐添加量 为培养基总质量的4 ‰。 3.根据权利要求1所述的一种防御假单胞菌FD6 发酵培养基， 其特征在 于， 所述K2HPO4和 MgSO4·7H2O质量比为1:1。 4.使用权利要求1 ‑3中任意一项权利要求所述的防御假单胞菌FD6发酵培养基对 防御 假单胞菌FD6进行发酵培养的方法， 其特征在于， 发酵培养条件为： 初始pH值为5.5~8.0、 装 液量为100~500 mL/L、 转速为140~240 r/min、 温度为2 0~37℃、 发酵时间为24~72 h； 发酵的 具体步骤： 挑取新鲜活化的FD6单菌落接种于LB试管培养液中， 置于28℃摇床中180  r/min 过夜摇培种 子液， 至OD600=0.8， 向初始pH值为5.5~8.0的发酵培养基中添加1 ‰的种子液， 置于温度为20~37℃、 转速为140~240 r/min摇床中摇培24~72 h。 5.根据权利 要求4所述的方法， 其特征在于， 发酵培养条件为： 初始pH值为6.97、 装液量 为100 mL/L、 转速为20 0 r/min、 温度为24.12℃、 发酵时间为6 0 h。 6.根据权利要求4所述的方法， 其特征在于， 防御假单胞菌FD6发酵产生的无菌上清滤 液对番茄灰霉病菌的抑制率与培养基初始pH、 精氨酸的添加量、 培养温度的二次多项回归 方程为: Y=‑2026.469+509.56350X1+89.764X2+21.40456X3‑7.86X1X2‑0.77875X1X3+ 1.22875X2X3‑34.099X12‑16.28225X22‑0.38186X32; 其中， Y代 表抑制率； X1代表培养基初始pH； X2代表精氨酸的添加量； X3代表培养温度。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 各因子对抑制率影响的主次顺序为： X3>X2> X1。 8.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 按1:8的体积比， 将防御假单胞菌FD6发酵 所产生的无菌上清滤液加入PDA培养基中， 对番茄灰霉病菌的平板抑制率理论最高值为 95.9396%。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115353996 A 2防御假单胞菌 FD6发酵培养基 及培养条件优化方 法 技术领域 [0001]本发明涉及一种防御假单胞菌FD6发酵培养基及培养条件优化方法， 属于细菌发 酵技术领域。 背景技术 [0002]灰葡萄孢(Botrytis  cinerea)引起的灰霉病在番茄 栽培种发生面积逐年增加， 已 经严重影响番茄的产量和品质(Sadfi ‑Zouaoui  N,Hannachi  I,Andurand  D,et  al.Biological  control of Botrytis  cinerea on stem wounds with moderately   halophilic  bacteria[J].World  Journal of Microbiology&Biotechnology,2008,24 (12):2871 ‑2877.)。 目前番茄灰霉病主要通过使用化学杀菌剂来控制， 虽然化学药剂有效， 但持续或重复使用会破坏天敌的生物防治， 对各种杀菌剂普遍产生抗药性(刘圣明,张艳 慧,高续恒,李梦,梅笑寒.洛阳市番茄灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性检测[J].中 国农学通报, 2014,30(22):300 ‑303.)。 假单胞菌产生的2,4 ‑二乙酰间苯三酚  (2,4‑DAPG)、 藤黄绿脓菌 素(pyoluteorin， PLT)、 硝吡咯菌素(pyrrolnitrin， PRN)、 氢氰酸  (hydrocyanic  acid， HCN)、 脂肽(lipopeptides)等次生代谢产物对植物病害都具有生物防治作用(Gross  H, Loper JE.Genomics  of secondary  metabolite  production  by Pseudomonas  spp.  Natural product reports.2009Nov； 26(11):1408‑46.)。 [0003]目前， 防假单胞菌FD6次生代谢产物的生产主要通过液体发酵培养基进行发酵。 实 验发现在不同的培养基和培养条件下防御假单胞菌FD 6的无菌上清滤液对番茄 灰霉病菌的 抑菌活性不同。 为了对防御假单胞菌FD 6次生代谢产 物深入地研究利用， 优化 发酵培养基和 培养条件十分重要。 现阶段对防御假单胞菌发酵条件优化研究很少， 对提高抑菌活性的研 究几乎没有， 这 不能很好 地满足防御假单 胞菌次生代谢产物深入地研究利用。 [0004]因此， 有必要研究出一种防御假单胞菌FD6发酵培养基及培养条件优化的方法来 提高抑菌活性 来应对现有技 术的不足， 以解决或减轻 上述一个或多个问题。 发明内容 [0005]本发明的目的在于针对现有技术中所存在的问题， 提供一种防御假单胞菌FD6发 酵培养基及培养条件优化方法， 显著增强了防御假单胞菌FD6的无菌上清滤液对番茄灰霉 病菌的抑菌活性。 [0006]本发明的目的是这样实现的： 一种防御假单胞菌FD6发酵培养基， 其特征在于， 所 述培养基含有碳源、 氮 源和无机盐； 其中碳源为甘油， 氮 源为精氨酸， 无机盐中含有K2HPO4和 MgSO4·7H2O。 [0007]所述培养基中甘油、 精氨酸、 无机盐的量分别为： 甘油添加量为培养基总质量的 5‰， 精氨酸添加量 为培养基总质量的1.98 ‰， 无机盐添加量 为培养基总质量的4 ‰。 [0008]所述K2HPO4和MgSO4·7H2O质量比为1:1。 [0009]防御假单胞菌FD6 发酵培养基对防御假单胞菌FD6进行发酵培养的方法， 其特征在说　明　书 1/9 页 3 CN 115353996 A 3