(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210691233.5 (22)申请日 2022.06.17 (83)生物保 藏信息 CCTCC NO:M 202 2197 202 2.03.04 (71)申请人 浙江工业大 学 地址 310014 浙江省杭州市拱 墅区潮王路 18号 (72)发明人 黄金　姜静　王广雪　 (74)专利代理 机构 杭州天正专利事务所有限公 司 33201 专利代理师 李世玉 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12N 9/38(2006.01) C12P 19/14(2006.01)C12P 19/12(2006.01) C12P 19/04(2006.01) C12P 19/00(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 阴沟肠杆菌Zj ut HJ2001及其在发酵产低聚 半乳糖中的应用 (57)摘要 本发明公开了一种阴沟肠杆菌Zjut  HJ2001 及其在发酵产低聚半乳糖中的应用， 本发明从土 壤中分离筛得的能有效地催化乳糖生产低聚半 乳糖的新菌株 ‑‑阴沟肠杆菌Zj ut HJ2001菌株及 在发酵产低聚半乳糖中的应用， 利用阴沟肠杆菌 发酵制备β ‑半乳糖苷酶粗酶液， 再将β ‑半乳糖 苷酶粗酶液添加到含0.3g/mL乳糖的磷酸钠缓冲 液中， 30℃条件下催化 反应36h， 低聚半乳糖的产 率可达27％。 本发明筛选的新菌株进行酶法制备 的GOS与市售GOS产品相比， 具有副产物含量低、 GOS纯度高的优势。 因此， 本发明阴沟肠杆菌Zj ut  HJ2001能有效地催化乳糖生产低聚半乳糖， 具有 一定的潜在应用价 值。 权利要求书1页 说明书6页 序列表1页 附图2页 CN 115141768 A 2022.10.04 CN 115141768 A 1.阴沟肠杆菌(Enterobacter  cloacae)Zjut  HJ2001， 保藏于中国典型培养物保藏中 心， 保藏号为CCTCC  NO:M 2022197， 保藏日期为2022年3月4日， 地址： 中国武汉， 武汉大学， 邮编， 430072。 2.一种权利要求1所述阴沟肠杆菌Zjut  HJ2001在发酵产低聚半乳糖中的应用。 3.如权利要求2所述的应用， 其特征在于， 所述应用的方法为： (1)将阴沟肠杆菌Zjut   HJ2001增殖培养和发酵培养后， 离心获得的湿菌体用pH  6.0‑8.0的缓冲液重悬后超声破 碎， 收集破碎上清液即为酶液； (2)将酶液加入乳糖和pH  6.0‑8.0的缓冲液中， 在30℃、 200r/min条件下转 化， 得到含有低聚半乳糖的粗酶转 化液， 分离提取， 得到低聚半乳糖。 4.如权利要求3所述的应用， 其特征在于， 步骤(2)所述酶液用量以缓冲液体积计为3 ‑ 15U/mL； 所述乳糖用量以缓冲液体积计为0.1 ‑0.5g/mL。 5.如权利要求3所述的应用， 其特 征在于， 步骤(1)所述酶液按如下 方法制备： 1)增殖培养： 将阴沟肠杆菌Zjut  HJ2001接种到增殖培养基中， 在转速180 ‑200r/min、 30℃的条件 下恒温培养16 ‑24h， 获得增殖培养液； 所述增殖培养基终浓度组成为： 乳糖15g/ L， 酵母浸膏10g/L， 蛋白胨5g/L， NaCl  4g/L， 溶剂为去离 子水； 2)发酵培养： 将步骤1)增殖培养液以体积浓度1 ‑5％的接种量接种在发酵培养基中， 于 转速180‑200r/min、 30℃的条件下恒温培养16 ‑24h， 获得发酵液； 所述发酵培养基终浓度组 成为： 乳糖15g/L， 酵母浸膏10 g/L， 蛋白胨5 g/L， 磷酸二氢钾0.5 g/L， 硫酸镁0.5g/L， 二水合 柠檬酸钠0.5g/L， 溶剂为去离 子水， 初始pH  7.0； 3)酶液： 将步骤2)得到的发酵液于4℃以8000rpm离心10min， 沉淀用pH  6.0‑8.0的磷酸 钠缓冲液洗涤、 离心后， 收集湿菌体并加入pH  6.0‑8.0的磷酸钠缓冲液重悬， 冰 水浴超声破 碎30min， 然后于4℃以80 00rpm离心10mi n， 收集上清液即为酶液。 6.如权利要求5所述的应用， 其特 征在于， 所述超声处 理条件： 3 00W、 超声2s、 间歇5s。 7.如权利要求5所述的应用， 其特征在于， 重悬用的缓冲液体积以湿菌体重量计为5 ‑ 15mL/g。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115141768 A 2阴沟肠杆菌Zjut  HJ2001及其在发酵产低聚半乳糖中的应用 (一)技术领域 [0001]本发明涉及一种阴沟肠杆菌Zjut  HJ2001及其在催化乳糖制备低聚半乳糖中的应 用。 (二)背景技术 [0002]低聚半乳糖(Galacto ‑oligosaccharides)是一种不能被人体消化， 但在结肠可被 益生菌选择性利用 的益生元， 由2～10个半乳糖基和一个末端葡萄糖基组成， 结构式为 (Galactose)n‑Glucose。 低聚半乳糖具有甜度低(甜度约为蔗糖的35％)， 水分活度低， 耐酸 以及耐高温等特点， 同时它具有促进双歧杆菌、 乳杆菌等肠道益生菌增殖， 提高机体免疫 力， 促进矿物质吸收， 缓解腹泻的功能。 由于其出色的理化性质和肠道调节功能， 低聚半乳 糖已广泛应用于婴幼儿配方食品、 糖果、 烘焙食品、 动物饲料等领域。 [0003]酶催化法合成是工业化生产低聚半乳糖的主要途径。 目前， 国内外已有许多关于 微生物来源的β ‑半乳糖苷酶合成低聚半乳糖的报道， 如开 菲尔乳杆菌、 双歧杆菌、 产酸克雷 伯氏菌、 米曲霉等。 但食品工业规模化生产中应用的β ‑半乳糖苷酶来源只有曲霉属和克鲁 维酵母菌属等少数几类微生物， 因此， 筛选新的性能优良的产β ‑半乳糖苷酶菌株来合成低 聚半乳糖具有重要的工业 化应用前 景。 (三)发明内容 [0004]本发明目的是提供一种阴沟肠杆菌(Enterobacter  cloacae)Zjut  HJ2001及其在 催化乳糖制备低聚半乳糖中的应用， 丰富了具有转糖基活性的β ‑半乳糖苷酶产酶菌株的来 源， 同时为应用该菌株所产β ‑半乳糖苷酶进行低聚半乳糖高效合成奠定基础。 [0005]本发明采用的技 术方案是： [0006]本发明提供一株新菌株 ‑‑阴沟肠杆菌(Enterobacter  cloacae)Zjut  HJ2001， 保 藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏号为CCTCC  NO:M 2022197， 保藏日期为2022年3月4日， 地址： 中国武汉， 武汉大 学， 邮编， 43 0072。 [0007]本发明所述阴沟肠杆菌Zjut  HJ2001是从土壤中筛选并分离出来， 于30℃在筛选 培养基平板上培养2 4h， 菌落呈圆形， 中间凸起， 表 面光滑、 粘稠， 不易挑取； 经革兰氏染色后 呈红色， 显微镜观察 为革兰氏阴性菌短杆菌， 无芽孢生成。 [0008]本发明还提供一种 所述阴沟肠杆菌Zjut  HJ2001在发酵产低聚半乳糖(GOS)中的 应用， 所述应用的方法为： (1)将阴沟肠杆菌Zjut  HJ2001增殖培养和发酵培养后， 离心获得 的湿菌体用pH  6.0‑8.0的缓冲液重悬后超声破碎， 收集破碎上清液即为 酶液； (2)将酶液加 入乳糖和pH  6.0‑8.0的缓冲液中， 在30℃、 200r/min条件下转化24 ‑48h， 得到含有低聚半乳 糖的粗酶转 化液， 分离提取， 得到低聚半乳糖。 [0009]优选的， 步骤(2)所述酶液用量以缓冲液体积计为3 ‑15U/mL， 优选5U/mL； 所述乳糖 用量以缓冲液体积计为0.1 ‑0.5g/mL， 优选 0.3g/mL。 [0010]优选的， 步骤(1)所述酶液按如下 方法制备：说　明　书 1/6 页 3 CN 115141768 A 3