(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210913412.9 (22)申请日 2022.07.25 (83)生物保 藏信息 CCTCC NO： M 2021 1418 2021.1 1.15 CCTCC NO： M 202 2704 202 2.05.23 (71)申请人 浙江工业大 学 地址 310014 浙江省杭州市拱 墅区潮王路 18号 (72)发明人 金利群　邢明林　鲁笛　汪贤文　 柳志强　郑裕国　 (74)专利代理 机构 杭州天正专利事务所有限公 司 33201 专利代理师 李世玉 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01)C12P 17/18(2006.01) C12R 1/465(2006.01) (54)发明名称 高产他克莫司低产子囊霉素的筑波链霉菌 ZJXM0001及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种高产他克莫司低产子囊 霉素的筑波链 霉菌ZJXM0001及其应用， 将筑波链 霉菌ZJXM0001接种至发酵培养基， 在26 ‑30℃、 180‑240rpm下培养144 ‑192h， 获得含 他克莫司的 发酵液， 发酵液分离纯化， 获得他克莫司； 本发明 通过UV、 ARTP诱变和抗性筛选的方法得到一株高 产他克莫司且副产物子囊霉素明显降低的筑波 链霉菌ZJXM0001菌株； 在温度28℃， 转速2 00rpm， 培养时间180h下相对原始筑波链 霉菌菌株S1， 筑 波链霉菌ZJXM0001菌株的他克莫司产量提高了 236％， 低产副产物子囊霉素， 在温度26℃， 其他 条件不变的情况下， 较原始菌株提升166％， 无子 囊霉素产生， 本发明方法对于后续的纯化、 提取 及工业化有着重要的意 义。 权利要求书1页 说明书11页 附图2页 CN 115386511 A 2022.11.25 CN 115386511 A 1.一种高产他克莫司低产子囊霉素的筑波链霉菌ZJXM0001(Streptomyces   tsuknbaenis  ZJXM0001)， 保藏于 中国典型培养物保藏中心， 保藏日期2021年11月15日， 保 藏编号CCTCC NO： M 20211418， 保藏 地址为中国武汉， 武汉大 学， 邮编43 0072。 2.一种权利要求1所述筑波链霉菌ZJXM 0001在微生物发酵制备他克 莫司中的应用。 3.如权利要求2所述的应用， 其特征在于， 所述的应用为： 将筑波链霉菌ZJXM0001接种 至发酵培养基， 在26 ‑30℃、 180 ‑240rpm下培养144 ‑192h， 获得含他克莫司的发酵液， 发酵液 分离纯化， 获得他克莫司； 所述发酵培养基终浓度组成为： 淀粉40～60g/L， 糊精30～50g/L， 葡萄糖5～20g/L， 酵母粉5～20g/L， 蛋白胨1～5g/L， (NH4)2SO2 0.5～1.5g/L， CaC O31～10g/ L， K2HPO4 0.5～1.5g/L， MgSO4 0.1～1g/L， 溶剂为水， pH为7.0 。 4.如权利要求3所述的应用， 其特征在于， 所述发酵培养基终浓度组成为： 淀粉55g/L， 糊精45g/L， 葡萄糖10g/L， 酵母粉15g/L， 蛋白胨3g/L， (NH4)2SO4 0.7g/L， CaCO38g/L， MgSO4  0.8g/L， K2HPO4 0.8g/L， 溶剂为水， pH  7.0。 5.如权利要求3所述的应用， 其特 征在于， 所述发酵 条件为28℃、 20 0rpm发酵培 养180h。 6.如权利要求3所述的应用， 其特征在于， 所述筑波链霉菌ZJXM0001发酵前， 先接种至 种子培养基， 培养获得的种子液再按体积浓度5 ‑15％的接种量接种至发酵培养基进 行发酵 培养， 所述种子培养过程如下： 将筑波链霉菌ZJXM0001接种至GYM固体培养基， 在28℃培养 4‑7天； 挑取单菌落， 接种到种子培养基中， 28℃、 220rpm培养48h， 获得种子液； GYM固体培养 基组成： 麦芽提取物10g/L， 葡萄糖4g/L， 酵母提取物4g/L， 琼脂粉20g/L， 碳酸钙2g/L， 溶剂 为水， pH7.0； 所述种子培养基组成如下： 甘油20～35g/L， 淀粉5～15 g/L， 葡萄糖5～15g/L， 酵母粉5～15g/L， CaCO3 0.5～1.5g/L， NaCl  5～15g/L， 溶剂为水， pH为7。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115386511 A 2高产他克莫司低产子囊霉素的 筑波链霉菌ZJXM0 001及其应用 (一)技术领域 [0001]本发明涉及诱变结合抗性筛选获得一株高产他克莫司， 低产子囊霉素的筑波  链 霉菌及其应用。 (二)背景技术 [0002]他克莫司(Tacrolimus， FK506)是一种23元环大环 内酯类抗生素， 它的分子  式是 C44H69NO12， 相对分子质量为804.02， 其结构见图1， 产物在常温下为无色  晶体， 难溶于 水， 易 溶于甲醇、 乙醇、 乙酸乙酯、 乙醚、 氯仿、 丙酮等有机溶剂。  熔点为127～129℃， 在不同贮存 条件下稳定性都较高。 于1984年由日本藤泽制  药公司从大阪筑波地区的土壤中发现 的筑 波链霉菌(Streptomycestsukubaen sis)的 发酵液中分离得到。 FK506临床上被广泛应用的 免疫抑制剂， 它的作用机制是能  抑制在免疫反应中使多种类型细胞相互作用的淋巴因子 的产生， 广泛用于预防移  植器官的排斥反应和治疗炎症性皮肤病和湿疹等自身免疫性疾 病。 在发现他克莫  司之前， 临床上常用环孢素A(C sA)作为免疫抑制剂来治疗器官移 植后的 排斥 反应。 CsA 也是一种CaN抑制剂， 免疫抑制机制与他克莫司类似， 但 他克莫司  的作用效 果是CsA的100倍左右， 自1994年FDA批准以来， FK506逐渐取代  环孢素的使用， 目前已成为 世界上治疗实体器官移 植患者最畅销的药物之一。 此  外， 它的神经保护和再生功能也引起 了人们对FK506研究的广泛关注。 近年，  FK506在免疫抑制剂市场的销售额已经占据全球 20％以上。 [0003]他克莫司的生产主要有两种方法： 化学合成法、 微生物发酵法。 化学法合成  他克 莫司合成路线长， 副产物多， 分离纯化困难， 原料成本高， 工业 化前景小。 [0004]微生物发酵法具有工艺流程简单、 底物廉价易得等优势， 在发酵法生产中主  要的 副产物是子囊霉素， 在部 分高产菌株中占比可达产 物的百分之五十， 因结构  与他克莫司极 其相似， 大大提高了 分离成本， 所以致力于获得高产他克莫司的同  时兼顾低产子囊霉素的 菌株是发酵法一个重要的探索方向。 [0005]链霉素是一种氨基糖苷类抗生素， 通过作用于核糖体30S 亚基而抑制mRNA  翻译起 始， 最终影响细菌的生长。 研究表明， 在低浓度的镁离子下， 核糖体70S  复合体稳定性提高 及与核糖体 mRNA， tRNA终止复合体解离密切相关的核糖体  循环因子水平的上升， 导致了该 突变株在生长稳定期出现异常的蛋白质合成活性，  最终引发抗生素的超量表达， 进而提高 筑波链霉菌中他克 莫司的产量。 [0006]苹果酸为白色结晶体或结晶状粉末易溶于水、 乙醇， 磷酸烯醇式丙酮酸羧化  酶 (ppc)的敲除对他克莫司的产量有明显的提升作用， 经发现苹果酸对ppc有  较强的抑制作 用， 所以利用苹果 酸作为选择压抑制p pc的活性。 [0007]现有主流诱变方式主要为UV与ARTP进行组合， 而对选择压的选择来提高  诱变率 的探索却很少， 基于上述原理， 本发明通过研究， 使用链霉素和苹 果酸作 为选择压， 来筛选 诱变的菌株， 最终 获得一株高产他克 莫司， 低产子囊霉素的筑  波链霉菌 。说　明　书 1/11 页 3 CN 115386511 A 3