(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210683743.8 (22)申请日 2022.06.17 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114752542 A (43)申请公布日 2022.07.15 (73)专利权人 佛山科学技术学院 地址 528000 广东省佛山市南海区狮山 镇 广云路33号 (72)发明人 张楠　康天灏　周明虎　严秀　 宋姝缇　 (74)专利代理 机构 广州嘉权专利商标事务所有 限公司 4 4205 专利代理师 黄琳娟 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) C12Q 1/18(2006.01) C12R 1/35(2006.01)(56)对比文件 CN 113755368 A,2021.12.07 CN 113957012 A,202 2.01.21 CN 105695362 A,2016.0 6.22 CN 112410248 A,2021.02.26 CN 105838641 A,2016.08.10 CN 112048566 A,2020.12.08 CN 110025778 A,2019.07.19 WO 20191 12028 A1,2019.0 6.13 Hongjun Chen et al.Identificati on of biofilm formati on by Mycoplas ma gallisepticum. 《Veteri nary Microbi ology》 .2012, 丁美娟等.鸡滑液囊支 原体不同地区分离 株 对常用抗菌药物的敏感性试验. 《中国兽药杂 志》 .2015,(第10期), 张鑫等.鸡滑液囊支 原体病理模型的建立及 感染途径探索. 《黑龙江畜牧兽医》 .2018,(第20 期), (续) 审查员 陈永强 (54)发明名称 鸡滑液囊支原体生物被膜的培育方法及其 应用、 筛选方法 (57)摘要 本发明涉及病原分离鉴定及病原培养技术 领域， 具体涉及一种鸡滑液囊支原 体生物被膜的 培育方法及其应用、 筛选方法。 该鸡滑液囊支原 体生物被膜的培育方法， 包括以下步骤： 将生长 至对数生长期的鸡滑液囊支原体用液体培养基 稀释至 （0.9 ‑1.5）×106 CFU/mL， 进行第一培育， 生长至对数生长期， 除去悬浮菌体， 制得鸡滑液 囊支原体生物被膜； 液体培养基为改良Frey氏液 体培养基， 生长至对数生长期的判断标准为改良 Frey氏液体培养基由红变黄； 第一培育的培育温 度为30‑37℃。 本发明能够在体外培育出鸡滑液 囊支原体生物被膜， 能够使 得生物实验中所测得的数据更加准确。 [转续页] 权利要求书1页 说明书12页 序列表1页 附图5页 CN 114752542 B 2022.09.13 CN 114752542 B (56)对比文件 李浩然等.滑液支 原体NADH氧化酶的酶学活 性及亚细胞定位研究. 《微 生物学通报》 .2019, (第03期), 高志刚 等.支 原体培养基配制工艺改进试 验. 《中国禽 业导报》 .2012,(第14期),第46页.Laura McAuliffe et al.Bi ofilm foramtion by mycoplas ma speicies and its role in enviromental persistence and survival. 《Microbi ology》 .2006,第152卷(第4 期),2/2 页 2[接上页] CN 114752542 B1.一种鸡滑液囊支原体生物被膜的培育方法， 其特征在于， 所述培育方法包括以下步 骤： 将生长至对数生长期的鸡滑液囊支原体用液体培养基稀释至 （0.9 ‑1.5）×106 CFU/mL， 进行第一培育， 生长至对数生长期， 除去悬浮菌体， 制得所述鸡滑液囊支原体生物被膜； 所 述第一培 育的培育环境为密封环境； 所述液体培养基为改良Frey氏液体培养基， 所述生长至对数生长期的判断标准为所述 改良Frey氏液体培 养基由红变黄； 所述第一培 育的培育温度为3 0‑37℃； 所述鸡滑液囊支原体生物被膜还进行染色观察， 所述染色观察的染色方法使用到 刚果 红。 2.根据权利要求1所述的培育方法， 其特征在于， 所述鸡滑液囊支原体经过分离培养、 传代培养和纯化培 养所制得。 3.根据权利要求1所述的培育方法， 其特征在于， 所述鸡滑液囊支原体还经过冻干保存 与复苏， 所述冻干保存的温度为0 至‑80℃。 4.根据权利要求1所述的培 育方法， 其特 征在于， 所述第一培 育的培育温度为32 ‑34℃。 5.根据权利要求1所述的培育方法， 其特征在于， 所述除去悬浮菌体的步骤为： 使用缓 冲液对培养基中的悬浮菌进行冲洗， 所述缓冲液为磷酸盐缓冲液， 所述磷酸盐缓冲液的pH 为6.5‑7.5、 浓度为0.0 5‑0.15 M。 6.根据权利要求1所述的培 育方法， 其特 征在于， 所述染色方法包括以下步骤： （1） 清洗： 所述鸡滑液囊支 原体生物被膜在缓冲液中清洗、 自然干燥； （2） 固定： 将清洗后的所述鸡滑液囊支 原体生物被膜固定 5‑20min、 自然干燥； （3） 染色： 将固定完成后的所述鸡滑液囊支原体生物被膜放入刚果红染色液中染色10 ‑ 20min； （4） 冲洗： 染色完成后的所述鸡滑液囊支 原体生物被膜放入蒸馏水中清洗、 自然干燥。 7.一种药物筛选方法， 其特征在于， 所述药物筛选方法包括以下步骤： 使用药物对权利 要求1‑6任一项所述的培育方法所制得的所述鸡滑液囊支原体生物被膜进行抗菌活性测 试； 所述药物为恩诺沙星、 多西环素、 泰乐菌素、 泰妙菌素中的至少一种。 8.权利要求1 ‑6任一项所述的培育方法制备得到的所述鸡滑液囊支原体生物被膜在药 物筛选中的应用； 所述药物为恩诺沙星、 多西环素、 泰乐菌素、 泰妙菌素中的至少一种。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114752542 B 3